劉廷銳，張超，朱文優(yōu)，*，凌生隆

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川成都610039；2.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓644000；3.四川省宜賓市思坡醋業(yè)有限責任公司，四川宜賓644000）

四川麩醋是我國四大名醋之一[1]，其以生麥麩為主要原料[2]、以中草藥醋曲為發(fā)酵劑、采用“糖化、酒化、醋化”三化同池發(fā)酵的獨特工藝釀制而成。四川麩醋色澤紅棕[3-4]、味道幽香、酸味柔和、體態(tài)澄清[5-6]，具有促進鈣和鐵吸收、降脂減肥、防治動脈硬化和美容養(yǎng)顏等諸多功能性作用[7]。

食醋的風味品質(zhì)不僅受生產(chǎn)原料及工藝條件的影響，其產(chǎn)地的地理氣候條件也會對食醋的風味產(chǎn)生影響[8]。有機酸是食醋中主要的風味物質(zhì)，國內(nèi)學者對鎮(zhèn)江香醋和山西老陳醋的有機酸含量進行了大量研究[9-10]，對四川麩醋的研究卻鮮有報道。余永建等[11]對市面上來自鎮(zhèn)江、上海和北京等50 種熟醋中的有機酸進行分析，但是并未包含四川麩醋。熊越等[12]對四川麩醋發(fā)酵過程中有機酸的變化進行聚類分析，將發(fā)酵過程分為6 個階段，但并未將四川麩醋與其它食醋做橫向?qū)Ρ确治?。本試驗以四川宜賓思坡醋廠固態(tài)發(fā)酵過程中的醋醅和市面上14 種不同產(chǎn)地的四川麩醋以及8 種外地典型代表食醋作為研究對象，運用高效液相色譜（high performance liquid chromatography ，HPLC）分析麩醋發(fā)酵過程中有機酸含量變化和不同地區(qū)熟醋有機酸含量的差異，為進一步研究四川麩醋的風味物質(zhì)提供依據(jù)，為后期構建四川麩醋指紋圖譜推動產(chǎn)業(yè)升級提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋醅采集于四川宜賓思坡醋廠且取樣方法一致，分別采集同一發(fā)酵批次過程中的第 1、3、5、7、9、12、14、16、18、21、23 天且于-20 ℃溫度下冷藏保存。22 種來自不同地區(qū)不同廠家的典型食醋均為市售，樣品相關信息見表1。

甲醇（色譜純）、硫酸鋅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、氯化鈉（分析純）：成都市科隆化學品有限公司；草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸均為標準品：北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司。

表1 22 種熟醋醋樣的相關信息Table 1 22 kinds of cooked vinegar-like information

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀Agilent 1220 infinity LC：美國安捷倫公司；色譜柱 Target-H（7.8×300 mm，10 μm）、預處理柱C18 SPE Cartridge：美國MS 科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理方法

對液態(tài)食醋，取10 mL 醋樣于100 mL 容量瓶中，加入2 mL 亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和2 mL 硫酸鋅溶液（300 g/L），搖勻后用超純水定容。靜置沉淀30 min，移取上清液，用0.22 μm 濾膜過濾，然后用C18 固相萃取小柱處理后上樣分析[13]。

對固態(tài)醋醅，稱取50 g 醋醅，加150 mL 超純水浸泡3 h，過濾，取濾液10 mL 并加入1 mL 亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和 1mL 硫酸鋅溶液（300 g/L），用超純水定容至50 mL，混勻靜置沉淀30 min，移取上清液，用0.22 μm 濾膜過濾，然后用C18 固相萃取小柱處理后上樣分析[14-15]。

1.3.2 高效液相色譜條件

色譜柱：Target-H 離子交換柱（7.8×300 mm，10 μm），流動相：10 mmol/L 稀硫酸，流速：0.6 mL/min，柱溫：58 ℃。進樣體積 10 μL，紫外檢測器波長：210 nm[16]。

1.3.3 有機酸標準曲線的制作

準確稱取7 種有機酸標準品置于100 mL 容量瓶中，用超純水溶解并定容，保存于4 ℃冰箱中?；旌蠘藴嗜芤旱臐舛纫姳?。

分別取不同體積（0、10、20、50、75、100 μL）的混標用超純水定容于10 mL 容量瓶中混勻，得不同濃度的標準品溶液。以峰面積對濃度繪制標準曲線，得線性范圍、回歸方程及相關系數(shù)[17]。

1.3.4 方法的精密度和重現(xiàn)性

選擇鎮(zhèn)江香醋作為醋樣經(jīng)過前處理后重復進樣5次以測定方法的重現(xiàn)性。計算相對標準偏差[18-19]。

表2 有機酸標準品配置濃度Table 2 Organic acid standard configuration concentration

1.3.5 方法的回收率

選擇鎮(zhèn)江香醋作為醋樣制作兩個一樣的樣品，一份加入一定量的標準品，一份不加，然后經(jīng)過相同的預處理等步驟上樣分析，計算其加標回收率[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析方法

根據(jù)每個有機酸標準品的濃度和出峰面積，計算樣品中對應的有機酸的含量。采用The unscramble9.7軟件對樣品中的有機酸含量情況進行主成分分析。

2 結果與討論

2.1 有機酸分析的方法學評價

2.1.1 有機酸的標準曲線

有機酸標準品高效液相圖譜如圖1 所示。

由圖1 可知，各有機酸分離良好。通過峰面積外標法定量，得到各有機酸的峰面積-濃度曲線及相關系數(shù)，結果見表3。

通過表3 可知，各有機酸相關系數(shù)R2>0.999，線性范圍良好，可以用于樣品定量分析。

2.1.2 方法重現(xiàn)性結果

方法重現(xiàn)性結果見表4。

圖1 混合有機酸標準溶液HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chart of mixed organic acid standard solution

表3 有機酸標準曲線的線性參數(shù)Table 3 Linear parameters of organic acid standard curve

表4 方法重現(xiàn)性結果Table 4 Method reproducible result mg/mL

通過表4 可知，相對偏差在1.79%～6.33%，重現(xiàn)性較好。

2.1.3 樣品加標回收率

樣品加標回收率結果見表5。

表5 樣品加標回收率結果Table 5 Sample spike recovery result mg/mL

從表5 可以看出，樣品的加標回收率為102.07%～109.47%，說明該方法的準確率較高，適用于有機酸的檢測分析。

2.2 不同地區(qū)食醋中有機酸含量差異分析以及四川麩醋發(fā)酵過程中有機酸含量變化分析

2.2.1 有機酸的分析結果

對來自11 個不同地區(qū)的22 種醋樣中有機酸含量以及四川麩醋發(fā)酵過程中有機酸含量變化進行分析，并根據(jù)有機酸標準曲線對其含量進行計算，結果見表6。

從表6 中可知，在熟醋中和醋醅固態(tài)發(fā)酵過程中，乙酸都是其含量最高的酸，占總有機酸58.12%，而含量次之的是乳酸，占總有機酸32.67%。這兩種酸的含量遠遠高于其它幾種有機酸[21-22]。在熟醋中，不同品種的食醋有機酸含量差別也較明顯，如S1 中乙酸含量為5.031 7 mg/mL，而S14 的乙酸含量卻只有1.776 8 mg/mL。又比如S1 中乳酸的含量為3.345 1 mg/mL，而S17 中的乳酸含量只有0.276 mg/mL。在四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的進行，其中草酸和檸檬酸變化不顯著，酒石酸和蘋果酸略有降低，琥珀酸先升高在降低，而其中乙酸由1.271 2 mg/mL 升高至3.121 4 mg/mL，乳酸由0.885 8 mg/mL 升高至1.321 6 mg/mL，它們相較與其它幾種有機酸含量變化較為顯著。

2.2.2 有機酸主成分分析結果

2.2.2.1 對熟醋中有機酸主成分分析

對熟醋中有機酸含量進行主成分分析，結果見圖2，圖2（a）為分數(shù)二維散點圖，該圖可用于解釋樣本之間的差異和相似性，樣本越接近，它們與相關的兩個組件越相似。相反，遠離彼此的樣品彼此不同。圖2（b）為x-變量的加載二維散點圖，該圖對于解釋X 數(shù)據(jù)中的最大變化，顯示了指定的兩個因子的不同變量的重要性。

表6 不同地區(qū)的醋樣以及四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過程中7 種有機酸含量Table 6 Vinegar in different regions and 7 kinds of organic acids in solid fermentation process of Sichuan bran vinegar mg/mL

從圖2（a）中可以看出，所有散點相聚不遠，顯示了食醋相似性，而其中S3～S14 這12 種四川麩醋尤為集中，顯示了四川麩醋之間的關聯(lián)性。它們都分布在PC2 的正方向上，且具有較高的載荷，結合圖2（b）分析可以得出四川麩醋與乳酸相關聯(lián)，這表明乳酸可以將四川麩醋與其地域的食醋有效的區(qū)分開，再根據(jù)表6 可以得出四川麩醋中的乳酸明顯高于其它地域的樣品。在圖2（a）和圖2（b）中可以看出同為四川麩醋的S1 和S2 兩種保寧醋在PC1 的正方向上有較高的載荷，它們和乙酸具有一定的關聯(lián)性，結合表6 說明保寧醋中乙酸含量較突出。

2.2.2.2 對四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過程中有機酸主成分分析

對發(fā)酵過程中有機酸主成分分析，結果見圖3。

圖2 熟醋主成分分析結果Fig.2 Finished vinegar principal component analysis results

圖3 四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過程中有機酸主成分分析結果Fig.3 Principal component analysis of organic acids during solidstate fermentation of Sichuan bran vinegar

圖3（a）顯示了3 d～10 d 具有相似性，12 d～18 d 具有相似性，21 d～23 d 具有相似性，由此可以把發(fā)酵過程大致分為4 個部分，第一部分1 d～2 d，第二部分3 d～10 d，第三部分 11 d～19 d，第四部分 20 d～23 d。圖3（a）顯示第二部分3 d～10 d 在PC2 的正方向上具有較高的載荷，結合圖3（b）可知發(fā)酵過程3 d～10 d 這個階段與乳酸具有較高的關聯(lián)性，表明乳酸可以作為這個階段特征有機酸可以區(qū)分開發(fā)酵過程中其它階段。結合表6 可知，此階段乳酸含量較之前顯著增高，然后開始降低，這可能是固態(tài)發(fā)酵過程中初始糖化和酒化階段，該階段乳酸菌大量繁殖產(chǎn)生大量乳酸[23-24]，然后進入醋酸發(fā)酵階段，該階段乙酸含量大量增加[25-27]。圖3（a）可以看出在12 d～23 d 在PC1 的正方向上具有較高的載荷，結合圖3（b）可知，該階段與乙酸相關聯(lián)，表明乙酸可以將這個階段與其它階段區(qū)分開，結合表6 可知，該階段乙酸含量顯著增高，這可能是前期和這個階段中醋酸發(fā)酵乙酸的持續(xù)積累和后熟階段少量乳酸被用作碳源轉(zhuǎn)化為乙酸的結果[28-30]。

3 結論

以22 種熟醋和發(fā)酵過程中四川麩醋醋醅作為研究對象，對樣品中的有機酸進行定量分析，通過結果可知在醋醅固態(tài)發(fā)酵過程中，乙酸是其含量最高的酸，占總有機酸58.12%，而含量次之的是乳酸，占總有機酸32.67%。在固態(tài)發(fā)酵過程中，7 種有機酸中乙酸和乳酸變化最為顯著，其它有機酸較之變化相對不明顯。對結果進行主成分分析發(fā)現(xiàn)，在熟醋中，乳酸對四川麩醋顯示了較高的相關性，乳酸的含量明顯高于其它地區(qū)的食醋，這表明乳酸可以將四川麩醋與其地域的食醋有效的區(qū)分開。在四川麩醋固態(tài)發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期與乳酸具有關聯(lián)性，乳酸含量變化顯著，這可能是前期糖化酒化階段，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸。后期與乙酸具有相關性，乙酸含量顯著升高，這可能是醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)生持續(xù)產(chǎn)生乙酸積累和后期用乳酸作為碳源產(chǎn)生乙酸的結果。本研究為闡明四川麩醋的關鍵風味物質(zhì)提供基礎數(shù)據(jù)，為后期構建四川麩醋指紋圖譜提供理論支持。