王彥陽，張中潤，鄭曉瑞，高燕

（1.江門職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東江門529090；2.廣東省綠色高性能新材料研發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣東江門529090；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州571737；4.廣東省農(nóng)科院植物保護研究所，廣東廣州510640）

腰果（Anacardium occidentale L.）原產(chǎn)巴西東北部地區(qū)，在我國已有80 多年的引種栽培歷史，我國海南西南和東南部，云南西雙版納都有引種栽培，是我國熱帶地區(qū)經(jīng)濟價值高、用途十分廣泛的珍貴植物[1]。腰果具有非常高的營養(yǎng)藥用和保健價值[2]，腰果酸對乳腺癌、宮頸癌有治療效果，可從食用的腰果樹果中分離出來，長期食用腰果果托或果汁可以控制腫瘤的生長，腰果中含有的脂肪有很好的軟化血管作用，對保護血管、防治心血管疾病大有益處[3]，有研究顯示濃縮腰果蛋白可作為營養(yǎng)添加劑添加入食品中[4]。目前有關(guān)腰果的研究集中在腰果蛋白的提取及其特性[5-9]、腰果脂肪提取工藝及腰果加工的報道[10-13]，而對腰果多酚研究較少。響應(yīng)面分析因其直觀地反映了各影響因素情況，效果優(yōu)于單因素試驗[14]。本研究基于響應(yīng)面法，對超聲波提取腰果葉多酚進行了工藝條件優(yōu)化，同時對腰果多酚進行了抗氧化性效應(yīng)研究，為進一步研究腰果葉多酚提供依據(jù)，使腰果得到進一步開發(fā)和利用。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

腰果葉：海南省東方市新龍鎮(zhèn)腰果園；沒食子酸（分析純）：上海研深實業(yè)有限公司；福林酚試劑（分析純）：美國 Sigma 公司；DPPH、抗壞血酸、ABTS、FeCl3、K3[Fe（CN）6]、二丁基羥基甲（butylated hydroxytoluene，BHT）、C2HCl3O2、無水乙醇（均為分析純）：東莞市萬信精細化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XO-5200DTS 超聲波清洗儀：上海金鵬分析儀器有限公司；LGJ-10 冷凍干燥機：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；Wo-600A 微型高速粉碎機：山東百百順儀器設(shè)備有限公司；E80 精細電子天平：天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；MS2200E 數(shù)字超聲波清洗儀：上海遂歐儀器有限公司；Hh2004 超靜離心機：湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；R-1300D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品進行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，參照Folin-Ciocalteu 法略有修改[15]。用少量蒸餾水溶解并定容0.50 g 沒食子酸至100 mL 得對照品溶液。取對照品溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 置于 8 個 50 mL容量瓶中定容。取上述溶液各0.5 mL 與1.25 mL 福林酚試劑搖勻后靜置反應(yīng)1 min，加入3.75 mL20%無水碳酸鈉溶液，定容至25 mL，30 ℃下靜置1.5 h 后測定其在765 nm 處的吸光度。

1.3.2 腰果葉多酚含量提取及測定

一定體積分數(shù)溶劑下，按一定溫度及超聲波處理時間萃取腰果葉粉末1.0 g 后得到粗提液。將粗提液5 000 r/min 離心5 min 后取上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除乙醇后用蒸餾水定容至100 mL 得腰果葉多酚提取液，4 ℃避光保存。取25 mL 腰果葉多酚提取液定容至50 mL，測定多酚質(zhì)量濃度，計算公式如下：

式中：W 為腰果葉多酚的提取率，%；M1為提取的腰果葉多酚的質(zhì)量，g；M2為腰果葉的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗

1）丙酮體積分數(shù)對腰果葉多酚提取率的影響：固定提取多酚時間為20 min，提取多酚溫度為30 ℃，料液比為 1 ∶20（g/mL），考察丙酮體積分數(shù)為 25%、35%、45%、55%、65%、75%對腰果葉多酚提取率的影響。

2）提取溫度對腰果葉多酚提取率的影響：固定提取多酚時間為20 min，丙酮體積分數(shù)為50%，料液比為 1 ∶20（g/mL），考察溫度 30、40、50、60、70、80 ℃對腰果葉多酚提取率的影響。

3）超聲波處理時間對腰果葉多酚提取率的影響：固定提取多酚溫度為30 ℃，丙酮體積分數(shù)為50%，料液比為 1 ∶20（g/mL），考察超聲波處理時間 30、50、70、90、110、130 min 對腰果葉多酚提取率的影響。

4）料液比對腰果多酚提取率的影響：固定提取多酚時間為20 min，提取多酚溫度為30 ℃，丙酮體積分數(shù)為 50%，考察料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）對腰果葉多酚提取率的影響。

1.3.4 Box－Behnken 試驗設(shè)計

選取丙酮體積分數(shù)（A）、提取溫度（B）、超聲波處理時間（C）3 個因素，分別考察其單獨作用時對腰果葉多酚提取率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，每個因素選取3 個對多酚提取率影響較大的水平，利用Design－Expert8.0 軟件建立因素和水平均為3 的響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Benhnken 模型，以丙酮體積分數(shù)（A）、提取溫度（B）、超聲波處理時間（C）為自變量，腰果葉多酚提取率為響應(yīng)值（Y）。正交試驗設(shè)計表見表1。

表1 正交試驗設(shè)計Table 1 Three factors and three levels of test design

1.3.5 腰果葉多酚抗氧化效應(yīng)

1.3.5.1 DPPH 自由基清除率的測定

將腰果多酚提取液用蒸餾水稀釋至不同濃度，取5.0 mL 與 5.0 mLDPPH（1 mmol/L）溶液混合后避光靜置 30 min，于 517 nm 處測定吸光值（n1）[16-17]。同時測定5.0 mL 蒸餾水與 5.0 mLDPPH 溶液、5.0 mL 相應(yīng)濃度提取液與5.0 mL 無水乙醇的517 nm 光吸收值（用n2、n3表示）。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（n1-n3）/n2]×100

1.3.5.2 ABTS+自由基清除率的測定

將 5.0 mL 7 mmol/L 的 ABTS+溶液與 88.0 μL 140 mmol/L 的 K2S2O8混合后于避光反應(yīng) 12 h～16 h 得到ABTS+備用液。參照周曄[18]等方法，將備用液用70%乙醇稀釋得ABTS+工作液。分別取不同濃度腰果總酚提取液 ABTS+工作液按 0.1 ∶3.9 體積比混合，室溫 25 ℃避光反應(yīng) 6 min～10 min 后測定吸光值（A樣品）；以蒸餾水和ABTS+工作液混合進行空白試驗（A空白）。

ABTS+自由基清除率/%=（A空白－A樣品）/A空白×100

1.3.5.3 鐵還原力測定

取 pH 值為 6.6 磷酸緩沖液 1 mL，加入 200 μL 腰果多酚提取液、10 mL 鐵氰化鉀溶液（1 g/L）后50 ℃恒溫水浴20 min；加入1 mL 10 %的三氯乙酸溶液2 500 r/min離心20 min 取上層清液2 mL；加入1 mL 三氯化鐵溶液（1 g/L）、2.0 mL 蒸餾水，振蕩混勻，700 nm處測定光吸收值。以同濃度的VC為對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0 進行數(shù)據(jù)處理，單因素試驗做3 次平行，用One-WayANOVA 進行方差分析，采用Tukey’s multiple range test 檢驗各處理間的差異，顯著水平P=0.05，具有不同英文小寫字母表示差異顯著。腰果葉多酚抗氧化效采用成對樣本t 檢驗進行顯著性分析，顯著水平P=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的確定

經(jīng)過對沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度和765 nm 波長處吸光度A 有關(guān)數(shù)據(jù)的記錄和分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

通過測定，沒食子酸質(zhì)量濃度與吸光值A(chǔ) 之間的曲線回歸方程為 y=0.001 9x+0.088 6（R2=0.975），線性關(guān)系良好。腰果多酚提取物含量測定能根據(jù)此方程計算得到。

2.2 腰果葉多酚提取單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 丙酮體積分數(shù)對腰果葉多酚得率的影響

丙酮體積分數(shù)對腰果葉多酚得率的影響見圖2。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

圖2 丙酮體積分數(shù)對腰果葉多酚得率的影響Fig.2 Effects of acetone volume fraction on extraction yield of polyphenols

由圖2 可知，丙酮體積分數(shù)為55%、65%時，對腰果葉多酚提取率為9.49%、9.31%，與其他體積分數(shù)形成顯著差異，表明丙酮體積分數(shù)對腰果葉多酚提取率有影響。丙酮體積分數(shù)為55%時多酚提取率達到最大值，隨后有所下降，原因可能是丙酮體積分數(shù)過高，脂溶性物質(zhì)溶出增大，從而影響了腰果葉多酚的提取率。因此選擇丙酮體積分數(shù)為55%作為最佳提取條件。

2.2.2 提取溫度對腰果葉多酚得率的影響

提取溫度對腰果葉多酚得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對腰果葉多酚得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield of polyphenols

由圖3 可知，提取溫度為 50、60、70 ℃時，對腰果葉多酚提取率為8.35%、8.85%、8.68%，與其他提取溫度形成顯著差異，表明提取溫度對腰果葉多酚提取率有影響。60 ℃以下溫度提取率與溫度呈正相關(guān)，60℃以上提取率與溫度呈負相關(guān)，推測是溫度上升對多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)造成了影響，從而降低了提取率。綜合考慮原料和試劑消耗等因素，選取為提取溫度50、60、70 ℃用于響應(yīng)面試驗。

2.2.3 超聲波處理時間對腰果葉多酚得率的影響

超聲波處理時間對腰果葉多酚得率的影響見圖4。

圖4 超聲波處理時間對腰果葉多酚得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic treatment time on extraction yield of polyphenols

由圖4 可知，超聲波處理時長為70、90、110 min時，對腰果多酚提取率為8.53%、8.70%、8.43%，與其他超聲波處理為時間形成顯著差異，表明超聲波處理為時間對腰果葉多酚提取率有影響。處理時間超過90 min 多酚提取率呈下降趨勢，推測是超聲波長時間作用使部分多酚分子結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多酚提取率降低。綜合考慮原料和試驗時長等因素，選取超聲波處理時長70、90、110 min 用于響應(yīng)面試驗。

2.2.4 料液比對腰果葉多酚得率的影響

料液比對腰果葉多酚得率的影響見圖5。

圖5 料液比對腰果葉多酚得率的影響Fig.5 Effects of solid to liquid ratio on extraction yield of polyphenols

結(jié)果表明，料液比對腰果多酚提取率的影響差異不顯著。

2.3 響應(yīng)面試驗

運用Desert-expert8.0.1 設(shè)計Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果見表2，模型方程方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

腰果葉多酚提取率與丙酮體積分數(shù)（A）、提取溫度（B）、超聲波處理時間（C）之間的二次多項式模型為：

Y=37.515 75+0.461 6A + 0.364 2B + 0.531 2C -0.000 2AB+0.000 65AC + 0.000 175BC - 0.003 81A2-0.002 91B2-0.003 09C2。

回歸模型 P＜0.000 1，失擬項 P=0.290 5＞0.05，模型具有高度的顯著性，對腰果葉多酚提取率有充分的理論預(yù)測。模型系數(shù)R2=0.986 0，提取溶劑、溫度、超聲波處理時間與提取率之間的真實關(guān)系在方程上體現(xiàn)出來。模型的變異率不到1.5%，可采用此模型確定丙酮體積分數(shù)、超聲波作用時間、提取溫度最佳提取工藝條件。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗表明：對多酚提取率影響主次順序依次為：丙酮體積分數(shù)＞超聲波作用時間＞提取溫度。因素 A 和 A2、B2、C2對多酚提取效果的線性效應(yīng)極顯著（P＜0.01）。

2.4 體積分數(shù)、溫度、超聲波作用時間交互作用分析

丙酮體積分數(shù)、溫度、超聲波作用時間響應(yīng)曲面見圖6。

圖6 丙酮體積分數(shù)、溫度、超聲波作用時間響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plot of acetone volume fraction，temperature and ultrasonic response time

交互作用曲面比較平滑的為AB，接近圓形的等高線，交互作用曲面比較陡峭的為AC 和BC，偏向橢圓的等高線，根據(jù)表3 顯著性可知AB、AC 和BC 交互作用均不顯著（P＞0.05）。

2.5 驗證模型及條件確定

腰果葉多酚提取的最優(yōu)工藝條件為丙酮體積分數(shù)57.90%、提取溫度58.79 ℃、超聲波處理時間89.49 min，此時響應(yīng)面模型預(yù)測提取率為10.33%。為簡化操作，選丙酮濃度60%，提取溫度60 ℃，超聲輔助提取時間90 min，按此條件進行5 次平行驗證試驗，多酚提取率平均值為10.29%，接近模型預(yù)測值10.33%，說明該模型可運用在實踐中。

2.6 腰果葉多酚抗氧化效應(yīng)

2.6.1 腰果葉多酚對DPPH 自由基清除效應(yīng)

腰果葉多酚提取物和VC對DPPH 自由基清除能力見圖7。

圖7 腰果葉多酚提取物對DPPH 自由基的清除率Fig.7 DPPH free radical clearance rate by polyphenol extract from cashew leaves

腰果葉多酚提取物對DPPH 自由基清除率隨濃度升高而加大，當(dāng)腰果葉多酚提取物濃度為5 mg/L 時，清除率為62%。腰果多酚提取物對DPPH 自由基的清除效應(yīng)比同濃度的VC高，自由基清除效果較好。

2.6.2 腰果葉多酚對ABTS+自由基清除效應(yīng)

腰果葉多酚提取物和VC對ABTS+自由基清除能力見圖8。

圖8 腰果葉多酚提取物對ABTS+的清除率Fig.8 ABTS+free radical clearance rate

腰果葉多酚提取物對ABTS+自由基的清除效應(yīng)隨著濃度的增大而增強，最高清除率為82%。各組濃度下，腰果葉多酚提取物對ABTS+自由基的清除效應(yīng)比同濃度的VC高，自由基清除效果較好。

2.6.3 還原力測定

腰果葉多酚提取物還原力測定見圖9。

圖9 Fe3+還原力測定Fig.9 Fe3+reducing power determination

通過測定鐵離子的還原力來表示腰果葉多酚提取物抗氧化活性的強弱。相同濃度下腰果葉多酚提取物的還原力均高于VC。

3 結(jié)論

本試驗通過超聲波輔助提取腰果葉多酚并對其抗氧化作用進行探討。在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化腰果葉多酚提取工藝。優(yōu)化結(jié)果為丙酮體積分數(shù)60%，提取溫度80 ℃，超聲波處理時間時間90 min，在此條件下腰果葉多酚提取率為10.29%，與10.33%的預(yù)測值接近。通過腰果葉多酚提取物對DPPH 自由基清除能力，ABTS+自由基清除能力，鐵離子還原能力，得出腰果葉多酚提取物具有抗氧化能力，抗氧化性高于同濃度天然VC，對研究腰果葉多酚的有效開發(fā)具有一定意義。