孫明哲

（長春職業(yè)技術(shù)學院食品與生物技術(shù)分院，吉林長春130033）

葛花（Puerariae flos）屬豆科多年生植物野葛[Pueraria lobata（willd.）Ohwi]的花蕾[1-3]，是傳統(tǒng)藥食兼用的原料[4]，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載了葛花的解酒醒脾作用[5]。葛花的化學成分包括黃酮類、生物堿類、皂苷類、揮發(fā)油等，其中異黃酮是葛花的主要功效成分[6-10]，研究表明，葛花異黃酮具有降壓、擴張血管、抗炎、保肝和抗氧化等功效[11-13]。但葛花異黃酮的提取、精制工藝不夠先進，不夠完善，限制了葛花異黃酮在食品、醫(yī)藥及其他領(lǐng)域的應(yīng)用。

超聲波提取法可通過對原料施加空化效應(yīng)和振動作用，可明顯提高效率，縮短時間，保護有效成分，應(yīng)用越來越廣泛[14-16]?；诂F(xiàn)有葛花異黃酮提取工藝落后，提取率和效率較低的缺點，本文采用超聲波輔助提取法對葛花異黃酮提取工藝進行優(yōu)化，以柱層析法精制，并評價葛花異黃酮的體外抗氧化活性，為葛花資源的精深開發(fā)及工業(yè)化應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

葛花：吉林省同仁堂大藥房，試驗前干燥、粉碎，過80 目篩備用。

葛根素標準品：中國食品藥品檢定研究院；HPD-100 型大孔樹脂：天津允開樹脂科技有限公司；DPPH、ABTS：Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700 型紫外可見光分光光度計：日本島津公司；BSA224S 型分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；XMTD-8222 型數(shù)顯控溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；CS-700Y 型多功能粉碎機：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；KS-600N 型超聲波萃取儀：上海柯祁儀器設(shè)備有限公司；RE-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1B-50 型真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

以95%的乙醇配制0.1 mg/mL 的葛根素標品溶液50 mL，分別取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 標品溶液置于10 mL 容量瓶中，以去離子水定容，并以去離子水為空白對照，于250 nm 處測定吸光度值[17]。線性擬合方程為：Y=12.12X-0.042（R2=0.998），在 0.002 mg/mL～0.014 mg/mL 范圍內(nèi)，葛根素線性良好。葛根素標準曲線見圖1。

圖1 葛根素標準曲線Fig.1 Standard curve of puerarin

1.3.2 葛花總異黃酮得率的測定

參照1.3.1 中的標準曲線方法測定葛花總異黃酮含量，得率計算公式為：

式中：A 為吸光度值；W 為樣品的質(zhì)量，g；V 為定容終體積，mL。

1.3.3 葛花總異黃酮提取工藝單因素試驗

影響葛花總異黃酮得率的主要因素有5 個，分別為超聲功率（50 W～400 W），乙醇濃度（40%～90%），固液比[1 ∶5（g/mL）～1 ∶30（g/mL）]，超聲溫度（40 ℃～90 ℃）和提取時間（10 min～60 min）等5 個因素，根據(jù)葛花總異黃酮得率高低，尋找各因素的最佳水平。

1.3.4 葛花總異黃酮提取工藝優(yōu)化試驗

參考單因素試驗結(jié)果，以總異黃酮得率為指標，選定超聲功率、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時間4 個因素，進行Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計。因素水平編碼情況見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 The levels of experimental factors

1.3.5 葛花總異黃酮的純化

采用HPD-100 型大孔樹脂對葛花總異黃酮進行純化，將處理過的樹脂放入層析柱中（6.0 cm×80 cm），上樣平衡后以80%乙醇水溶液，1.5 mL/min 洗脫流速進行洗脫，收集洗脫液，減壓蒸餾，冷凍干燥備用。

1.3.6 葛花總異黃酮的體外抗氧化活性測定

以純化后的葛花總異黃酮為測試對象，測定其體外抗氧化活性，按張海容等[18]的方法測定DPPH·清除率；按曹清明等[19]的方法測定ABTS+·清除率；按周婧琦等[20]的方法測定O2-·的清除率；按王彥平等[21]的方法測定總還原力。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3 次，試驗結(jié)果以平均值±標準差來表達，試驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 軟件和Duncan 法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率對葛花總異黃酮得率的影響

超聲波萃取主要利用超聲波的熱學機理和機械震動，功率越大，其作用越強，進而對原料的作用就越顯著[22]。超聲功率對葛花總異黃酮得率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對葛花總異黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

由圖2 可知，隨超聲功率的增大，葛花總異黃酮的得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當超聲功率達到250 W時，得率達到最大，為（11.54±0.14）mg/g，但功率高于250 W 時，總異黃酮顯著降低，超聲功率過高可能引起劇烈的空化效應(yīng)，破壞化學鍵，引起異黃酮的結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致總異黃酮得率的降低。超聲功率250 W 最佳。

2.1.2 乙醇濃度對葛花總異黃酮得率的影響

乙醇濃度對葛花總異黃酮得率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對葛花總異黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

由圖3 可得，隨乙醇濃度的升高，葛花總異黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當乙醇濃度為70%時，葛花異黃酮得率最高，達到（12.48±0.13）mg/g，表明70%乙醇與葛花異黃酮結(jié)合最為緊密，溶解性最好。因此，最佳乙醇濃度為70%。

2.1.3 固液比對葛花總異黃酮得率的影響

固液比對葛花總異黃酮得率的影響見圖4。

由圖 4 可得，固液比為 1 ∶15（g/mL）時，總異黃酮得率最大為（10.78±0.11）mg/g，隨著溶劑體積增加，使得提取物中的其他雜質(zhì)過多釋放，導(dǎo)致總異黃酮得率降低。因此，最佳固液比為 1 ∶15（g/mL）。

圖4 固液比對葛花總異黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid ratio on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

2.1.4 超聲溫度對葛花總異黃酮得率的影響

超聲波萃取中，溫度對原料中有效成分的釋放起到非常關(guān)鍵的作用，適當?shù)臏囟瓤纱龠M有效成分的釋放，提高有效成分的得率[23]。超聲溫度對葛花總異黃酮得率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對葛花總異黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

由圖5 可見，隨超聲溫度的升高，葛花總異黃酮得率具有先增加后減小的變化趨勢，當超聲溫度為70 ℃時，總異黃酮的得率最高，達到（11.18±0.13）mg/g。異黃酮類化合物對溫度較敏感，溫度過高則分解，致使得率降低。因此，最佳超聲溫度為70 ℃。

2.1.5 超聲時間對葛花總異黃酮得率的影響

超聲時間對總異黃酮得率的影響見圖6。

由圖6 可見，隨超聲時間延長，葛花總異黃酮得率呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，當提取時間達到40 min 時，總異黃酮得率達到（11.55±0.14）mg/g，此后，總異黃酮得率變化趨于平緩。超聲時間過長則產(chǎn)品能耗增加，有效成分釋放緩慢，因此，超聲時間為40 min 最佳。

圖6 超聲時間對葛花總異黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

2.2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析

參考單因素試驗結(jié)果，以總異黃酮得率為指標，以超聲功率250 W、乙醇濃度70%、超聲溫度70 ℃和固液比 1 ∶15（g/mL）為中心，組合設(shè)計 29 個試驗方案，試驗方案及結(jié)果如表2 所示，對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果如表3 所示。

表2 試驗方案及試驗結(jié)果Table 2 The experimental design and results

續(xù)表2 試驗方案及試驗結(jié)果Continue table 2 The experimental design and results

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

以總異黃酮得率為響應(yīng)值，建立的回歸方程為：Y=-19.241+0.261A+0.358B+0.557C-0.077D+0.145AB-0.214AC-0.221AD+0.088BC-0.113BD+0.269CD+0.129A2-0.184B2-0.493C2-0.872D2。

由表3 方差分析結(jié)果可見，回歸模型極顯著（p＜0.000 1），相關(guān)系數(shù)R2=0.953 6，與調(diào)整負相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.927 4 差值較小，失擬項不顯著（p=0.094 3＞0.05），表明方程擬合良好；信噪比為17.615，相對較大，變異系數(shù)為1.13%，表明方程精度高，誤差小，可以準確預(yù)測葛花總異黃酮得率的變化。

模型的一次項A、B 和C 對葛花總異黃酮得率影響顯著（p＜0.05），交互項 AB、AD、BD 對葛花總異黃酮得率影響顯著（p＜0.05），交互項 AC、CD、二次項 A2、B2、C2和D2對葛花總異黃酮得率影響極顯著（p＜0.01），影響的主次順序為 A＞C＞B＞D，即超聲功率＞超聲溫度＞乙醇濃度＞固液比。

2.2.2 最優(yōu)提取條件確定與顯著性驗證

通過響應(yīng)面的嶺脊分析，確定的葛花總異黃酮提取的最優(yōu)條件如下：超聲功率258.4 W，乙醇濃度73.6%，提取溫度 75.6 ℃，固液比 1 ∶15.8（g/mL），葛花總異黃酮得率的理論值可達到12.38 mg/g。根據(jù)實驗室及工業(yè)生產(chǎn)實際進行修正后，得到的葛花總異黃酮提取最優(yōu)工藝如下：超聲功率260 W，乙醇濃度74%，提取溫度 76 ℃，固液比 1 ∶16（g/mL），以此最優(yōu)工藝條件重復(fù)進行5 次試驗，得到葛花總異黃酮的平均得率為（12.35±0.37）mg/g，相對誤差為 0.24%，與預(yù)測值的吻合度超過99%，回歸模型確定的葛花總異黃酮提取工藝真實可靠，具有實用價值。

2.3 葛花總異黃酮純化

葛花總異黃酮的純化選用HPD-100 型大孔樹脂層析法，層析柱平衡后上樣，洗脫溶劑為80%乙醇水溶液，洗脫流速為1.5 mL/min，間隔3 min 收集一次，并測定異黃酮含量，得到異黃酮洗脫曲線如圖7 所示，葛花總異黃酮洗脫曲線只有一個洗脫峰，最高值出現(xiàn)在第19 管，即57 min 時，因此洗脫峰的收集自33 min 開始，至84 min 結(jié)束，將收集到的液體真空濃縮，冷凍干燥備用，其總異黃酮純度為（69.37±0.72）%。

圖7 葛花總異黃酮洗脫曲線Fig.7 Desorption curve of total isoflavones from Puerariae flos

2.4 葛花總異黃酮體外抗氧化活性的研究

葛花總異黃酮對 DPPH·、ABTS+·和 O2-·的清除率及總還原能力見圖8。

圖8 葛花總異黃酮對DPPH·、ABTS+·和O2-·的清除率及總還原能力Fig.8 DPPH·，ABTS+·and O2-·radical scavenging activities and reducing power of total isoflavones from Puerariae flos

由圖8 可見，葛花總異黃酮濃度越大，DPPH·清除率越高，并在總異黃酮濃度為600 μg/mL 時達到100%（圖8a），其DPPH·的清除率強于野葛塊根異黃酮[24]（600 μg/mL 時清除率約40 %）和鳶尾葉異黃酮[25]（600 μg/mL 時清除率約 70%）；對 ABTS+·的清除率最大出現(xiàn)在總異黃酮濃度為400 μg/mL 時，最大值達到100%（圖8b），其清除能力強于黑豆芽、黃豆芽和綠豆芽異黃酮[26]；對 O2-·的清除率在 0～200 μg/mL 呈線性增加，超過200 μg/mL 以后增加緩慢，至600 μg/mL時達到了最大值（圖8c），其清除能力強于葛根異黃酮[27]（1 000 μg/mL 時清除率約89 %）；總還原力在6.25 μg/mL～400 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，且在濃度為400 μg/mL 時達到最大吸光度值，此時總還原力最強（圖8d），其還原力略強于大豆異黃酮[28]。對葛花總異黃酮的DPPH·、ABTS+·和O2-·清除率進行回歸分析，方程分別為：Y（DPPH·）=17.99X-6.81，R2=0.972；Y（ABTS+·）=15.12X+4.68，R2=0.927；Y（O2-·）=16.69X-18.36，R2=0.944，劑量效應(yīng)明顯。與對照組VC比較，雖抗氧化性稍弱，但作為天然原料，其抗氧化活性極具開發(fā)價值。

3 結(jié)論

響應(yīng)面優(yōu)化的葛花總異黃酮超聲輔助提取條件為：超聲時間40 min，超聲功率260 W，乙醇濃度74%，提取溫度 76 ℃，固液比 1 ∶16（g/mL），總異黃酮得率最高達到（12.35±0.37）mg/g，回歸方程精確度高，試驗誤差較小。精制后的葛花總異黃酮純度達到（69.37±0.72）%。葛花總異黃酮在體外對 DPPH·、ABTS+·和O2-·表現(xiàn)出較好的清除效果，清除率可達100%，并具有還原能力。葛花總異黃酮具有較強的體外抗氧化活性。論文后續(xù)將針對葛花總異黃酮的體內(nèi)抗氧化活性及機理進行探討。