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        超聲波輔助提取葛花總異黃酮及體外抗氧化活性研究

        2020-02-22 08:00:22孫明哲
        食品研究與開發(fā) 2020年3期

        孫明哲

        (長春職業(yè)技術(shù)學院食品與生物技術(shù)分院,吉林長春130033)

        葛花(Puerariae flos)屬豆科多年生植物野葛[Pueraria lobata(willd.)Ohwi]的花蕾[1-3],是傳統(tǒng)藥食兼用的原料[4],《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載了葛花的解酒醒脾作用[5]。葛花的化學成分包括黃酮類、生物堿類、皂苷類、揮發(fā)油等,其中異黃酮是葛花的主要功效成分[6-10],研究表明,葛花異黃酮具有降壓、擴張血管、抗炎、保肝和抗氧化等功效[11-13]。但葛花異黃酮的提取、精制工藝不夠先進,不夠完善,限制了葛花異黃酮在食品、醫(yī)藥及其他領(lǐng)域的應(yīng)用。

        超聲波提取法可通過對原料施加空化效應(yīng)和振動作用,可明顯提高效率,縮短時間,保護有效成分,應(yīng)用越來越廣泛[14-16]?;诂F(xiàn)有葛花異黃酮提取工藝落后,提取率和效率較低的缺點,本文采用超聲波輔助提取法對葛花異黃酮提取工藝進行優(yōu)化,以柱層析法精制,并評價葛花異黃酮的體外抗氧化活性,為葛花資源的精深開發(fā)及工業(yè)化應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料與試劑

        葛花:吉林省同仁堂大藥房,試驗前干燥、粉碎,過80 目篩備用。

        葛根素標準品:中國食品藥品檢定研究院;HPD-100 型大孔樹脂:天津允開樹脂科技有限公司;DPPH、ABTS:Sigma 公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        UV-1700 型紫外可見光分光光度計:日本島津公司;BSA224S 型分析天平:賽多利斯科學儀器有限公司;XMTD-8222 型數(shù)顯控溫水浴鍋:上海精宏實驗設(shè)備有限公司;CS-700Y 型多功能粉碎機:永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司;KS-600N 型超聲波萃取儀:上海柯祁儀器設(shè)備有限公司;RE-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;FD-1B-50 型真空冷凍干燥機:北京博醫(yī)康儀器有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 標準曲線的繪制

        以95%的乙醇配制0.1 mg/mL 的葛根素標品溶液50 mL,分別取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 標品溶液置于10 mL 容量瓶中,以去離子水定容,并以去離子水為空白對照,于250 nm 處測定吸光度值[17]。線性擬合方程為:Y=12.12X-0.042(R2=0.998),在 0.002 mg/mL~0.014 mg/mL 范圍內(nèi),葛根素線性良好。葛根素標準曲線見圖1。

        圖1 葛根素標準曲線Fig.1 Standard curve of puerarin

        1.3.2 葛花總異黃酮得率的測定

        參照1.3.1 中的標準曲線方法測定葛花總異黃酮含量,得率計算公式為:

        式中:A 為吸光度值;W 為樣品的質(zhì)量,g;V 為定容終體積,mL。

        1.3.3 葛花總異黃酮提取工藝單因素試驗

        影響葛花總異黃酮得率的主要因素有5 個,分別為超聲功率(50 W~400 W),乙醇濃度(40%~90%),固液比[1 ∶5(g/mL)~1 ∶30(g/mL)],超聲溫度(40 ℃~90 ℃)和提取時間(10 min~60 min)等5 個因素,根據(jù)葛花總異黃酮得率高低,尋找各因素的最佳水平。

        1.3.4 葛花總異黃酮提取工藝優(yōu)化試驗

        參考單因素試驗結(jié)果,以總異黃酮得率為指標,選定超聲功率、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時間4 個因素,進行Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計。因素水平編碼情況見表1。

        表1 因素水平編碼表Table 1 The levels of experimental factors

        1.3.5 葛花總異黃酮的純化

        采用HPD-100 型大孔樹脂對葛花總異黃酮進行純化,將處理過的樹脂放入層析柱中(6.0 cm×80 cm),上樣平衡后以80%乙醇水溶液,1.5 mL/min 洗脫流速進行洗脫,收集洗脫液,減壓蒸餾,冷凍干燥備用。

        1.3.6 葛花總異黃酮的體外抗氧化活性測定

        以純化后的葛花總異黃酮為測試對象,測定其體外抗氧化活性,按張海容等[18]的方法測定DPPH·清除率;按曹清明等[19]的方法測定ABTS+·清除率;按周婧琦等[20]的方法測定O2-·的清除率;按王彥平等[21]的方法測定總還原力。

        1.3.7 數(shù)據(jù)處理

        所有試驗重復(fù)3 次,試驗結(jié)果以平均值±標準差來表達,試驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 軟件和Duncan 法。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗

        2.1.1 超聲功率對葛花總異黃酮得率的影響

        超聲波萃取主要利用超聲波的熱學機理和機械震動,功率越大,其作用越強,進而對原料的作用就越顯著[22]。超聲功率對葛花總異黃酮得率的影響見圖2。

        圖2 超聲功率對葛花總異黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

        由圖2 可知,隨超聲功率的增大,葛花總異黃酮的得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,當超聲功率達到250 W時,得率達到最大,為(11.54±0.14)mg/g,但功率高于250 W 時,總異黃酮顯著降低,超聲功率過高可能引起劇烈的空化效應(yīng),破壞化學鍵,引起異黃酮的結(jié)構(gòu)變化,導(dǎo)致總異黃酮得率的降低。超聲功率250 W 最佳。

        2.1.2 乙醇濃度對葛花總異黃酮得率的影響

        乙醇濃度對葛花總異黃酮得率的影響見圖3。

        圖3 乙醇濃度對葛花總異黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

        由圖3 可得,隨乙醇濃度的升高,葛花總異黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,當乙醇濃度為70%時,葛花異黃酮得率最高,達到(12.48±0.13)mg/g,表明70%乙醇與葛花異黃酮結(jié)合最為緊密,溶解性最好。因此,最佳乙醇濃度為70%。

        2.1.3 固液比對葛花總異黃酮得率的影響

        固液比對葛花總異黃酮得率的影響見圖4。

        由圖 4 可得,固液比為 1 ∶15(g/mL)時,總異黃酮得率最大為(10.78±0.11)mg/g,隨著溶劑體積增加,使得提取物中的其他雜質(zhì)過多釋放,導(dǎo)致總異黃酮得率降低。因此,最佳固液比為 1 ∶15(g/mL)。

        圖4 固液比對葛花總異黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid ratio on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

        2.1.4 超聲溫度對葛花總異黃酮得率的影響

        超聲波萃取中,溫度對原料中有效成分的釋放起到非常關(guān)鍵的作用,適當?shù)臏囟瓤纱龠M有效成分的釋放,提高有效成分的得率[23]。超聲溫度對葛花總異黃酮得率的影響見圖5。

        圖5 提取溫度對葛花總異黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

        由圖5 可見,隨超聲溫度的升高,葛花總異黃酮得率具有先增加后減小的變化趨勢,當超聲溫度為70 ℃時,總異黃酮的得率最高,達到(11.18±0.13)mg/g。異黃酮類化合物對溫度較敏感,溫度過高則分解,致使得率降低。因此,最佳超聲溫度為70 ℃。

        2.1.5 超聲時間對葛花總異黃酮得率的影響

        超聲時間對總異黃酮得率的影響見圖6。

        由圖6 可見,隨超聲時間延長,葛花總異黃酮得率呈現(xiàn)逐漸增加趨勢,當提取時間達到40 min 時,總異黃酮得率達到(11.55±0.14)mg/g,此后,總異黃酮得率變化趨于平緩。超聲時間過長則產(chǎn)品能耗增加,有效成分釋放緩慢,因此,超聲時間為40 min 最佳。

        圖6 超聲時間對葛花總異黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on the yield of total isoflavones from Puerariae flos

        2.2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

        2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析

        參考單因素試驗結(jié)果,以總異黃酮得率為指標,以超聲功率250 W、乙醇濃度70%、超聲溫度70 ℃和固液比 1 ∶15(g/mL)為中心,組合設(shè)計 29 個試驗方案,試驗方案及結(jié)果如表2 所示,對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析,結(jié)果如表3 所示。

        表2 試驗方案及試驗結(jié)果Table 2 The experimental design and results

        續(xù)表2 試驗方案及試驗結(jié)果Continue table 2 The experimental design and results

        表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

        以總異黃酮得率為響應(yīng)值,建立的回歸方程為:Y=-19.241+0.261A+0.358B+0.557C-0.077D+0.145AB-0.214AC-0.221AD+0.088BC-0.113BD+0.269CD+0.129A2-0.184B2-0.493C2-0.872D2。

        由表3 方差分析結(jié)果可見,回歸模型極顯著(p<0.000 1),相關(guān)系數(shù)R2=0.953 6,與調(diào)整負相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.927 4 差值較小,失擬項不顯著(p=0.094 3>0.05),表明方程擬合良好;信噪比為17.615,相對較大,變異系數(shù)為1.13%,表明方程精度高,誤差小,可以準確預(yù)測葛花總異黃酮得率的變化。

        模型的一次項A、B 和C 對葛花總異黃酮得率影響顯著(p<0.05),交互項 AB、AD、BD 對葛花總異黃酮得率影響顯著(p<0.05),交互項 AC、CD、二次項 A2、B2、C2和D2對葛花總異黃酮得率影響極顯著(p<0.01),影響的主次順序為 A>C>B>D,即超聲功率>超聲溫度>乙醇濃度>固液比。

        2.2.2 最優(yōu)提取條件確定與顯著性驗證

        通過響應(yīng)面的嶺脊分析,確定的葛花總異黃酮提取的最優(yōu)條件如下:超聲功率258.4 W,乙醇濃度73.6%,提取溫度 75.6 ℃,固液比 1 ∶15.8(g/mL),葛花總異黃酮得率的理論值可達到12.38 mg/g。根據(jù)實驗室及工業(yè)生產(chǎn)實際進行修正后,得到的葛花總異黃酮提取最優(yōu)工藝如下:超聲功率260 W,乙醇濃度74%,提取溫度 76 ℃,固液比 1 ∶16(g/mL),以此最優(yōu)工藝條件重復(fù)進行5 次試驗,得到葛花總異黃酮的平均得率為(12.35±0.37)mg/g,相對誤差為 0.24%,與預(yù)測值的吻合度超過99%,回歸模型確定的葛花總異黃酮提取工藝真實可靠,具有實用價值。

        2.3 葛花總異黃酮純化

        葛花總異黃酮的純化選用HPD-100 型大孔樹脂層析法,層析柱平衡后上樣,洗脫溶劑為80%乙醇水溶液,洗脫流速為1.5 mL/min,間隔3 min 收集一次,并測定異黃酮含量,得到異黃酮洗脫曲線如圖7 所示,葛花總異黃酮洗脫曲線只有一個洗脫峰,最高值出現(xiàn)在第19 管,即57 min 時,因此洗脫峰的收集自33 min 開始,至84 min 結(jié)束,將收集到的液體真空濃縮,冷凍干燥備用,其總異黃酮純度為(69.37±0.72)%。

        圖7 葛花總異黃酮洗脫曲線Fig.7 Desorption curve of total isoflavones from Puerariae flos

        2.4 葛花總異黃酮體外抗氧化活性的研究

        葛花總異黃酮對 DPPH·、ABTS+·和 O2-·的清除率及總還原能力見圖8。

        圖8 葛花總異黃酮對DPPH·、ABTS+·和O2-·的清除率及總還原能力Fig.8 DPPH·,ABTS+·and O2-·radical scavenging activities and reducing power of total isoflavones from Puerariae flos

        由圖8 可見,葛花總異黃酮濃度越大,DPPH·清除率越高,并在總異黃酮濃度為600 μg/mL 時達到100%(圖8a),其DPPH·的清除率強于野葛塊根異黃酮[24](600 μg/mL 時清除率約40 %)和鳶尾葉異黃酮[25](600 μg/mL 時清除率約 70%);對 ABTS+·的清除率最大出現(xiàn)在總異黃酮濃度為400 μg/mL 時,最大值達到100%(圖8b),其清除能力強于黑豆芽、黃豆芽和綠豆芽異黃酮[26];對 O2-·的清除率在 0~200 μg/mL 呈線性增加,超過200 μg/mL 以后增加緩慢,至600 μg/mL時達到了最大值(圖8c),其清除能力強于葛根異黃酮[27](1 000 μg/mL 時清除率約89 %);總還原力在6.25 μg/mL~400 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系,且在濃度為400 μg/mL 時達到最大吸光度值,此時總還原力最強(圖8d),其還原力略強于大豆異黃酮[28]。對葛花總異黃酮的DPPH·、ABTS+·和O2-·清除率進行回歸分析,方程分別為:Y(DPPH·)=17.99X-6.81,R2=0.972;Y(ABTS+·)=15.12X+4.68,R2=0.927;Y(O2-·)=16.69X-18.36,R2=0.944,劑量效應(yīng)明顯。與對照組VC比較,雖抗氧化性稍弱,但作為天然原料,其抗氧化活性極具開發(fā)價值。

        3 結(jié)論

        響應(yīng)面優(yōu)化的葛花總異黃酮超聲輔助提取條件為:超聲時間40 min,超聲功率260 W,乙醇濃度74%,提取溫度 76 ℃,固液比 1 ∶16(g/mL),總異黃酮得率最高達到(12.35±0.37)mg/g,回歸方程精確度高,試驗誤差較小。精制后的葛花總異黃酮純度達到(69.37±0.72)%。葛花總異黃酮在體外對 DPPH·、ABTS+·和O2-·表現(xiàn)出較好的清除效果,清除率可達100%,并具有還原能力。葛花總異黃酮具有較強的體外抗氧化活性。論文后續(xù)將針對葛花總異黃酮的體內(nèi)抗氧化活性及機理進行探討。

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