李煥婷，安 明，賈克文，張 茹，高博聞

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

1 前言

在我國出產(chǎn)的卷柏屬植物約為70多種，其中有20多種具有藥用價(jià)值[1]，廣泛分布于我國東北、華北、華東、中南及陜西、四川等地。墊狀卷柏又名九死還魂草，為中國藥典2015年版所收載品種，其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物活性強(qiáng)，具有活血通經(jīng)之功效[2]。

近幾年，越來越多的學(xué)者對(duì)卷柏中化學(xué)成分進(jìn)行分析，因此，在卷柏中通過提取分離并鑒定出一系列新的、復(fù)雜的化合物。其中，黃酮類、酚炔類等化合物都具有較好的藥理活性。卷柏分布極其廣泛，具有良好的藥用價(jià)值，但是對(duì)于不同產(chǎn)地卷柏化學(xué)成分的研究比較少。本次實(shí)驗(yàn)以我國不同地區(qū)的卷柏為研究對(duì)象，利用HPLC法分析不同地區(qū)卷柏化學(xué)成分的差異；通過指紋圖譜處理軟件分析不同種卷柏的共有峰、相似度，為其臨床用藥、質(zhì)量控制提供依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)中主要儀器見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)中所用到的五種產(chǎn)地卷柏及所用試劑見表2和表3。

表2 卷柏藥材來源

表3 實(shí)驗(yàn)試劑

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate LP-C18(4.6mm×250mm,5.0μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脫(見表4)，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長330nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。

表4 流動(dòng)相梯度洗脫條件

3.2 供試品溶液的制備

稱取卷柏粉末約2g，置于小燒杯中，精密加入80%(體積分?jǐn)?shù)下同)甲醇20mL，保鮮膜密封，用電子天平稱其質(zhì)量，在50℃下超聲提取40min，放冷，然后再一次稱其質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足差量，搖勻，過濾，再經(jīng)0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液進(jìn)樣。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取供試品溶液S3，按照3.1中所列的色譜條件24小時(shí)內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣六次。

3.3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密量取供試品溶液S3六份，按照3.1中所列的色譜條件24小時(shí)內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣六次。

3.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取供試品溶液S3，按照2.1中所列的色譜條件24小時(shí)內(nèi)每隔4小時(shí)檢測(cè)一次。

4 結(jié)果與討論

4.1 卷柏樣品HPLC指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)

按照3.1中所列的色譜條件，測(cè)出5個(gè)樣品的高效液相色譜圖，將5個(gè)色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版。經(jīng)系統(tǒng)處理，得到5種產(chǎn)地供試品的相似度(見表5)、共有峰(見圖1)，最終確立了6個(gè)峰為5個(gè)樣品的共有峰，同時(shí)得到這6個(gè)共有峰在5個(gè)供試品HPLC色譜圖中的保留時(shí)間、峰面積(見表6)。共有峰的選取原則為5批樣品都含有的峰，且出峰時(shí)間合適并與其臨近的峰分離良好[3]。

表5 HPLC圖譜相似度評(píng)估結(jié)果

表6 共有峰的峰面積與保留時(shí)間

4.2 方法學(xué)考察結(jié)果

4.2.1精密度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)表明，主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.67%，相對(duì)峰面積RSD均小于4.31%，表明該方法精密度良好。

4.2.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)表明，主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD小于1.78%，相對(duì)峰面積RSD小于2.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

4.2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)顯示，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間均小于2.93%，相對(duì)峰面積的RSD值小于1.24%，表明樣品溶液在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性好。

4.3 討論

4.3.1檢測(cè)波長的選擇

于全波長檢測(cè)器下對(duì)供試品溶液進(jìn)行分析，在波長330nm處色譜峰最多、紫外吸收良好，最終確定在330nm波長下對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)。

4.3.2流動(dòng)相的選擇

通過選用不同流動(dòng)相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸)、不同洗脫條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果甲醇-0.1%磷酸水在相應(yīng)梯度條件下得到的色譜峰分離效果最好。

5 結(jié)論

在指紋圖譜處理軟件中，以湖北卷柏HPLC圖譜為參照，以中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.20，進(jìn)行色譜峰自動(dòng)匹配，生成了5種產(chǎn)地卷柏的指紋圖譜，并得到6個(gè)分離度較好的共有峰；各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，相對(duì)峰面積則存在較大差異，說明不同來源的卷柏生長表型不同，但含有一定的共有成分，只是含量有所差異；5種產(chǎn)地卷柏相似度高達(dá)0.901～0.983，說明各地卷柏所含化學(xué)成分極其相似。該實(shí)驗(yàn)方法簡單易行，可作為卷柏質(zhì)量控制及指紋圖譜建立的方法。