范龐雙 龐先瓊

大多數(shù)肺癌患者被診斷時(shí)已處于晚期，存活率低[1-2]。放射療法(Radiation therapy，RI)是一種廣泛用于臨床抗癌細(xì)胞的治療方式，但許多患者表現(xiàn)出對(duì)RI獲得性放射抗性導(dǎo)致治療失敗[3-4]。miRNA是一類內(nèi)源小非編碼RNA，通過(guò)阻斷靶mRNA的翻譯在基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮作用[5-6]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA對(duì)包括肺癌在內(nèi)的多種類型癌癥的放射敏感性也起著關(guān)鍵作用。例如，miR-616的低表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的放射敏感性顯著相關(guān)[7]。此外，已發(fā)現(xiàn)miR-616上調(diào)與NSCLC患者的放射效力減弱和中位生存時(shí)間縮短有關(guān)，而對(duì)miR-616的抑制則通過(guò)刺激細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)放射抗性[8]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制物-2(Tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)在幾種人類惡性腫瘤中被證實(shí)為抑癌基因，通過(guò)抑制LATS2基因以及基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9等抑制口腔癌的轉(zhuǎn)移[9]；TIMP-2還可以靶向CD44或TIMP3抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。本研究擬探討miR-616通過(guò)靶向TIMP-2增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制，為肺癌放射治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人肺癌HCC827細(xì)胞培養(yǎng)及分組設(shè)計(jì)

人肺癌HCC827細(xì)胞購(gòu)自南京科比奧生物技術(shù)公司，細(xì)胞在含有10%胎牛血清，2 mM L-谷氨酰胺，100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2的飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。使用第10和20代之間的細(xì)胞，每24 h更換完全培養(yǎng)基。

HCC827細(xì)胞組：HCC827細(xì)胞在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)；RI組：HCC827細(xì)胞使用X射線發(fā)生器進(jìn)行X射線照射，即以4 Gy/min的固定劑量率發(fā)射，用于照射細(xì)胞的X射線的能量分級(jí)為8 Gy，照射孵育時(shí)間為24 h；miR-616 inhibitor組：為了敲低miR-616的表達(dá)，將HCC827細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，按照制造商推薦的程序使用LipofectamineTM2000，用miR-616-shRNA(5′-GAAGGAGAGGCAACTGGAT-3′)靶向轉(zhuǎn)染HCC827細(xì)胞；miR-616 inhibitor+RI組：使用LipofectamineTM2000，用miR-616-shRNA靶向轉(zhuǎn)染HCC827細(xì)胞，隨后使用X射線發(fā)生器進(jìn)行X射線照射。

1.2 細(xì)胞活力及細(xì)胞集落形成測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，使用MTT方法測(cè)定細(xì)胞增殖情況。各組細(xì)胞加入20 μL MTT(5 mg/mL)，隨后將96孔板在5%CO2中于37℃培養(yǎng)箱中溫育。4 h 后，棄去液體并向每個(gè)孔中加入150 μL二甲基亞砜。振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀中以570 nm的波長(zhǎng)測(cè)量光密度(OD)值，以蒸餾水為空白組，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。各組細(xì)胞接種在10 cm組織培養(yǎng)皿中的軟瓊脂中并培養(yǎng)1周以允許集落形成。集落定義為由至少10個(gè)細(xì)胞組成。將集落用4%多聚甲醛固定，用吉姆薩染色，并用肉眼或立體顯微鏡計(jì)數(shù)。形成的集落數(shù)目表示為克隆形成數(shù)目。

1.3 細(xì)胞凋亡測(cè)定

各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，使用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶分離細(xì)胞，并收集到流動(dòng)管中，細(xì)胞離心并棄去上清液。然后用冷PBS洗滌細(xì)胞三次并再次離心，棄去上清液。根據(jù)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V-FITC)凋亡檢測(cè)試劑盒，將1×106個(gè)細(xì)胞重懸于100 μL 膜聯(lián)蛋白-V-FITC/PI溶液中，搖動(dòng)并混合，然后在室溫下孵育15 min，加入1 mL HEPES溶液，振蕩并混合。在525、620 nm帶通濾波器中，在488 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)FITC和PI熒光，進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.4 細(xì)胞周期水平測(cè)定

各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞三次，離心棄上清液。然后通過(guò)PBS重懸細(xì)胞并調(diào)節(jié)至1×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度。隨后，在1℃下預(yù)冷的1 mL 75%乙醇將細(xì)胞在4℃下固定1 h，然后將細(xì)胞以7 500 rpm離心5 min。然后棄去使用的冷乙醇，用PBS沖洗細(xì)胞兩次，然后除去上清液。此后，細(xì)胞在37℃，黑暗條件下用100 μL RNaseA水洗30 min，在4℃下用碘化丙錠(PI)染色。在避光的條件下放置30 min。使用流式細(xì)胞儀記錄激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm的紅色熒光以檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.5 細(xì)胞侵襲水平測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶分離各組中的細(xì)胞，并重復(fù)研磨以制備單細(xì)胞懸浮液。然后在兩次PBS沖洗后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1.5×105個(gè)細(xì)胞/mL。將100 μL細(xì)胞懸浮液接種到Transwell小室中，并將500 μL含有10%FBS的培養(yǎng)基加入到基底外側(cè)室中。在37℃孵育后10～12 h，移除小室，使用棉芽將未能穿透膜的細(xì)胞擦掉。然后將細(xì)胞用95%乙醇固定15 min并用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。在三次PBS漂洗和自然風(fēng)干之后，將腔室倒置在載玻片上并使用熒光顯微鏡拍照。從每個(gè)濾膜中隨機(jī)選擇五個(gè)視圖(200×)以計(jì)算跨膜細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)五次。

1.6 細(xì)胞miR-616、TIMP-2基因表達(dá)水平測(cè)定

根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用TRIzol試劑從各組細(xì)胞中分離總RNA。通過(guò)Multiscribe RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用TaqMan microRNA測(cè)定miR-616、TIMP-2基因表達(dá)水平，并歸一化至U6。使用的引物序列如下：miR-616：5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′(正向)和5′-ATACTCCTGCTTGCTGA TCC-3′(反向)；TIMP-2：5′-GCCAAAGCGGTCAGTGAGA-3′(正向)和5′CCTGGTGCCCGTTGG GTT-3′(反向)；U6：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(正向)和5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(反向)；用7300 Fast Real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。根據(jù)-2△△CT方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.7 細(xì)胞TIMP-2蛋白表達(dá)水平測(cè)定

將制備的細(xì)胞和組織在冰上在RIPA裂解緩沖液補(bǔ)充PMSF蛋白酶抑制劑中裂解30 min。在4℃下以14 000×g離心30 min后，收集上清液。按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡。人抗-TIMP-2的單克隆抗體，人抗β-肌動(dòng)蛋白均以1∶1 000稀釋，二抗均以1∶4 000稀釋。

1.8 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 各組HCC827細(xì)胞OD值、存活率水平的比較

與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor組、miR-616 inhibitor+RI組的OD值、存活率顯著降低(P<0.05)；與RI組、miR-616 inhibitor組比較，miR-616 inhibitor+RI組的OD值、存活率顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組HCC827細(xì)胞OD值、存活率水平的比較Table 1 Comparison of OD value and survival rate of HCC827 cells in each group

Note：aP<0.05，compared with the HCC827 cells group；bP<0.05，compared with the RI group；cP<0.05，compared with the miR-616 inhibitor group.

2.2 各組HCC827細(xì)胞克隆形成數(shù)目的比較

與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor組、miR-616 inhibitor+RI組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目降低(P<0.05)；與RI組、miR-616 inhibitor組比較，miR-616 inhibitor+RI組細(xì)胞克隆形成數(shù)目降低(P<0.05)(圖1，表2)。

2.3 各組HCC827細(xì)胞凋亡率的比較

與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor組、miR-616 inhibitor+RI組的凋亡率升高(P<0.05)，與RI組、miR-616 inhibitor組比較，miR-616 inhibitor+RI組的凋亡率升高(P<0.05)(表3)。

表2 各組HCC827細(xì)胞克隆形成數(shù)目的比較Table 2 Comparison of the number of clone formation in each group of HCC827 cells

Note：aP<0.05，compared with the HCC827 cells group；bP<0.05，compared with the RI group；cP<0.05，compared with the miR-616 inhibitor group.

表3 各組HCC827細(xì)胞凋亡率的表達(dá)Table 3 Apoptotic rates of HCC827 cells in each group

Note：aP<0.05，compared with the HCC827 cells group；bP<0.05，compared with the RI group；cP<0.05，compared with the miR-616 inhibitor group.

2.4 各組HCC827細(xì)胞G1期比較

與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor組、miR-616 inhibitor+RI組的G1期升高(P<0.05)；與RI組、miR-616 inhibitor組比較，miR-616 inhibitor+RI組G1期升高(P<0.05)(圖2，表4)。

2.5 各組HCC827細(xì)胞侵襲遷移能力的比較

與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor組、miR-616 inhibitor+RI組穿膜數(shù)降低(P<0.05)；與RI組、miR-616 inhibitor組比較，miR-616 inhibitor+RI組穿膜數(shù)降低(P<0.05)(圖3，表5)。

2.6 各組HCC827細(xì)胞miR-616、TIMP-2 mRNA表達(dá)水平比較

與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor組、miR-616 inhibitor+RI組的miR-616 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與RI組、miR-616 inhibitor組比較，miR-616 inhibitor+RI組miR-616 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor組、miR-616 inhibitor+RI組的TIMP-2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與RI組、miR-616 inhibitor組比較，miR-616 inhibitor+RI組TIMP-2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)(表6)。

2.7 各組HCC827細(xì)胞TIMP-2蛋白表達(dá)水平比較

與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor組、miR-616 inhibitor+RI組TIMP-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與RI組、miR-616 inhibitor組比較，miR-616 inhibitor+RI組TIMP-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖4，表7)。

表4 各組HCC827細(xì)胞G1期比較Table 4 Comparison of cell cycle at the G1 phase of HCC827 cells in each group

Note：aP<0.05，compared with the HCC827 cells group；bP<0.05，compared with the RI group；cP<0.05，compared with the miR-616 inhibitor group.

表5 各組HCC827細(xì)胞侵襲遷移能力的比較Table 5 Comparison of invasion and migration ability of HCC827 cells in each group

Note：aP<0.05，compared with the HCC827 cells group；bP<0.05，compared with the RI group；cP<0.05，compared with the miR-616 inhibitor group.

表7 各組HCC827細(xì)胞TIMP-2蛋白表達(dá)水平比較Table 7 The expression of TIMP2 protein in HCC827 cells

Note：aP<0.05，compared with the HCC827 cells group；bP<0.05，compared with the RI group；cP<0.05，compared with the miR-616 inhibitor group.

2.8 miR-616與TIMP-2 mRNA和蛋白相關(guān)分析

相關(guān)分析顯示，miR-616與TIMP-2 mRNA、蛋白呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)(表8)。

圖2 各組HCC827細(xì)胞G1期比較Figure 2 Comparison of cell cycle at the G1 phase of HCC827 cells in each groupNote：A.HCC827 cell group；B.RI group；C.miR-616 inhibitor group；D.miR-616 inhibitor + RI group.

圖3 各組HCC827細(xì)胞穿膜數(shù)的比較Figure 3 Comparison of the number of transmembrane HCC827 cells in each groupNote：A.HCC827 cell group；B.RI group；C.miR-616 inhibitor group；D.miR-616 inhibitor + RI group.

表6 各組HCC827細(xì)胞miR-616、TIMP-2 mRNA表達(dá)水平比較Table 6 The expression of miR-616 mRNA and TIMP2 mRNA in HCC827 cells

Note：aP<0.05，compared with the HCC827 cells group；bP<0.05，compared with the RI group；cP<0.05，compared with the miR-616 inhibitor group.

圖4 各組HCC827細(xì)胞TIMP-2蛋白表達(dá)水平比較Figure 4 The expression of TIMP-2 protein in HCC827 cellsNote：A.HCC827 cell group；B.RI group；C.miR-616 inhibitor group；D.miR-616 inhibitor + RI group.

表8 miR-616與TIMP-2 mRNA和蛋白相關(guān)分析Table 8 The relationship between miR-616 and TIMP-2 genes

3 討論

肺癌是常見(jiàn)類型的呼吸系統(tǒng)腫瘤，具有高度侵襲性。如今，放射治療在很大程度上提高了肺癌患者的總體生存率，并被公認(rèn)為是患者治療的首選。闡明調(diào)節(jié)放射敏感性的潛在機(jī)制至關(guān)重要。miR-616已被定性為癌基因并在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。miR-616促進(jìn)了乳腺癌的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變和轉(zhuǎn)移[11]；miR-616有助于黏液腺癌的侵襲性表型。有充分證據(jù)表明下調(diào)miR-616并用作多種腫瘤中的腫瘤抑制因子，包括肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、和肝細(xì)胞癌[12]。據(jù)報(bào)道，miR-616可作為食管癌、胃癌、乳腺癌的預(yù)后生物標(biāo)志物。在膀胱癌細(xì)胞中經(jīng)常觀察到miR-616的高表達(dá)，而通過(guò)抑制劑降低miR-616的表達(dá)水平可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯顯著抑制癌細(xì)胞增殖[13]。本研究結(jié)果顯示，與HCC827細(xì)胞組比較，RI組和miR-616 inhibitor+RI組OD值、存活率水平、克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)降低，與RI組比較，miR-616 inhibitor+RI組OD值、存活率水平、克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)降低。與HCC827細(xì)胞組比較，RI組和miR-616 inhibitor+RI組凋亡率、G1期升高，與RI組比較，miR-616 inhibitor+RI組凋亡率、G1期升高。同時(shí)說(shuō)明miR-616的表達(dá)下調(diào)可以在體外增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放射敏感性，進(jìn)而增強(qiáng)輻射介導(dǎo)的活力抑制、細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)停滯。

TIMP-2是金屬肽酶(TIMPs)家族組織抑制劑的成員，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)[14]。METP2的降解是腫瘤轉(zhuǎn)移的先決條件。TIMP-2也是含有亮氨酸-拉鏈結(jié)構(gòu)域的CREB/ATF轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。從涉及細(xì)胞發(fā)育、增殖到細(xì)胞對(duì)應(yīng)激信號(hào)和DNA損傷的反應(yīng)[15]。證據(jù)顯示癌細(xì)胞中TIMP-2表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖。先前研究表明，TIMP-2通過(guò)降低存活率和DNA損傷來(lái)抑制肺癌細(xì)胞的順鉑和放射抗性[16]。研究表明，預(yù)后良好的患者放化療后TIMP-2水平顯著升高[17]；miR-301a通過(guò)直接靶向多發(fā)性骨髓瘤中的TIMP-2促進(jìn)細(xì)胞增殖；miR-19a通過(guò)調(diào)節(jié)TIMP-2表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后和凋亡相關(guān)[18]。PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑與許多生理功能相關(guān)，包括細(xì)胞增殖、炎癥和惡性轉(zhuǎn)化。越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA可能影響PI3K/AKT信號(hào)通路。直接靶向和抑制該途徑可能增加放射敏感性并減少癌細(xì)胞的遷移和侵襲。PI3K和AKT的磷酸化是PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，通?？梢蕴岣叻派浜蟀┘?xì)胞的存活率。本研究中，與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor+RI組miR-616 mRNA表達(dá)水平降低，與RI組比較，miR-616 inhibitor+RI組miR-616 mRNA表達(dá)水平降低。與HCC827細(xì)胞組比較，RI組、miR-616 inhibitor+RI組TIMP-2 mRNA表達(dá)水平升高，與RI組比較，miR-616 inhibitor+RI組TIMP-2 mRNA表達(dá)水平升高。轉(zhuǎn)染miR-616 inhibitor后，肺癌細(xì)胞中TIMP-2 mRNA、蛋白水平表達(dá)增加，而給予放療處理后，TIMP-2 mRNA、蛋白水平升高更為明顯。這與上述討論一致，同時(shí)說(shuō)明靶向抑制miR-616可促進(jìn)TIMP-2基因、蛋白的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放射敏感性。

綜上所述，miR-616的表達(dá)下調(diào)可以在體外增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放射敏感性，進(jìn)而增強(qiáng)輻射介導(dǎo)的癌活力抑制、細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)停滯，其機(jī)制可能與抑制miR-616可促進(jìn)TIMP-2基因、蛋白的表達(dá)有關(guān)。