李佳，沈瀚，顧兵

1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210008；2.徐州醫(yī)科大學(xué) 附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 徐州 221002；3.徐州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，徐州市實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221002

據(jù)統(tǒng)計(jì)每年大約有超過(guò)3億例由細(xì)菌感染引起的致命性疾病，造成200多萬(wàn)人喪失生命[1]。如果細(xì)菌感染可以在早期階段得到有效治療，那么存活率可以大大提高[2]。因此，臨床上迫切需要快速、靈敏和成本較低的檢測(cè)致病菌的技術(shù)。目前，我國(guó)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原菌的檢測(cè)仍依賴(lài)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，包括在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)、對(duì)細(xì)菌菌落進(jìn)行形態(tài)分析，以及進(jìn)行細(xì)菌代謝物的測(cè)定，一般需要3～5 d才能出報(bào)告，耗時(shí)耗力[3]。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因芯片、質(zhì)譜技術(shù)以及二代測(cè)序技術(shù)作為傳統(tǒng)檢測(cè)方法的補(bǔ)充，在病原菌的鑒定與藥敏試驗(yàn)中得到了一些探索與應(yīng)用，但仍存在不少問(wèn)題，離臨床應(yīng)用距離較遠(yuǎn)?；蛐酒夹g(shù)雖然具有高通量、快速和自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)，但儀器設(shè)備成本昂貴而難以用于臨床[4]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）是目前逐步用于臨床微生物快速鑒定的革命性技術(shù)，遺憾的是該技術(shù)不能用于病原菌的藥敏檢測(cè)，且儀器價(jià)格昂貴在一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用[5]。二代測(cè)序技術(shù)也是目前細(xì)菌鑒定和耐藥性分析的有力工具，但成本較高，且目前生物信息學(xué)人才缺乏，面對(duì)海量信息的測(cè)序結(jié)果，難以短時(shí)間內(nèi)得到正確可靠的分析結(jié)果，限制了測(cè)序技術(shù)在臨床的推廣[5-6]。因此，非常需要研發(fā)一種速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的臨床病原菌檢測(cè)方法[7]。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、成本較低和方便攜帶等很多優(yōu)點(diǎn)[8-9]，從而在化學(xué)和生物領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[10-13]。早在1989年，Holt和Cotton就首次對(duì)細(xì)菌的SERS圖譜進(jìn)行了報(bào)道[14]。4年之后，Magee教授又提出利用整個(gè)生物體的指紋譜圖譜對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè)是完全有可能實(shí)現(xiàn)的[15]。此后，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草桿菌、蠟樣芽孢桿菌及傷寒沙門(mén)菌等細(xì)菌的指紋譜及基于SERS檢測(cè)細(xì)菌的新方法被相繼報(bào)道[16-19]?？梢?jiàn)，SERS為病原菌的快速檢測(cè)打開(kāi)了新的大門(mén)。菌體表面成分復(fù)雜，含有多種生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、多糖等，普通的分析方法很難對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)、原位及無(wú)損檢測(cè)。SERS的高靈敏及指紋譜等特點(diǎn)可以滿(mǎn)足病原微生物檢測(cè)快速、準(zhǔn)確的要求。

1 SERS的基本理論

1928年，印度科學(xué)家拉曼（Raman）首次發(fā)現(xiàn)了拉曼散射現(xiàn)象，其攜帶的分子結(jié)構(gòu)信息，能直觀(guān)地為分子的振動(dòng)、化學(xué)鍵、基團(tuán)的研究提供檢測(cè)手段，因此是一種表征分子結(jié)構(gòu)振動(dòng)的非彈性散射光譜。然而，信號(hào)弱這一缺點(diǎn)限制了拉曼光譜的實(shí)際應(yīng)用。直到1974年，F(xiàn)leischmann等發(fā)現(xiàn)吸附在粗糙銀電極表面的吡啶分子的拉曼信號(hào)得到極大提高，這個(gè)現(xiàn)象稱(chēng)為SERS[20]。與其他光譜檢測(cè)方法相比，SERS具有如下明顯優(yōu)勢(shì)：SERS提供物質(zhì)分子獨(dú)特的指紋譜信息以實(shí)現(xiàn)未知物的定性定量檢測(cè)；SERS檢測(cè)靈敏度很高，理想情況下SERS增強(qiáng)因子可達(dá)到1010～1014，可以實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)[21-22]；SERS譜帶較窄，譜峰分辨率高，可以有效避免熒光背景干擾，適用于多組分同時(shí)探測(cè)；SERS檢測(cè)對(duì)樣品要求低，固相、液相和氣相的樣品都可以檢測(cè)。

SERS的增強(qiáng)主要有2個(gè)機(jī)制，即電磁增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)[23]。普遍認(rèn)為遠(yuǎn)程電磁增強(qiáng)和短程化學(xué)增強(qiáng)效應(yīng)對(duì)放大拉曼信號(hào)同時(shí)起作用[24]。通常，電磁增強(qiáng)的增強(qiáng)因子被認(rèn)為是106～108的量級(jí)，而化學(xué)增強(qiáng)的增強(qiáng)因子只能是102量級(jí)?；瘜W(xué)增強(qiáng)，即分子在貴金屬粗糙表面的某些位點(diǎn)被吸收，來(lái)自分子的電子與來(lái)自金屬表面的電子相互作用，產(chǎn)生與共振拉曼散射類(lèi)似的增強(qiáng)效應(yīng)[25]。由于增強(qiáng)底物、吸附分子和相互吸附位點(diǎn)不同，化學(xué)增強(qiáng)產(chǎn)生的SERS增強(qiáng)效果也不同[26]。與化學(xué)增強(qiáng)相比，由局域表面等離子體共振的激發(fā)引起的電磁機(jī)制增強(qiáng)被認(rèn)為是產(chǎn)生SERS現(xiàn)象的主要原因[27]。傳導(dǎo)電子的振蕩可以發(fā)生在貴金屬納米顆粒、尖銳的金屬尖端或粗糙的金屬表面，在這個(gè)過(guò)程中，它可以導(dǎo)致局部電磁場(chǎng)的重新分布，使得貴金屬納米顆粒周?chē)囟ㄎ恢玫碾姶艌?chǎng)的大幅增強(qiáng)[28]。這種增強(qiáng)具有很強(qiáng)的距離依賴(lài)性，距離的微小減小可以導(dǎo)致強(qiáng)度的顯著提高，只有分子非常接近金屬表面才可以產(chǎn)生巨大的場(chǎng)強(qiáng)。因此，SERS檢測(cè)成功的關(guān)鍵是使待測(cè)物質(zhì)與SERS底物表面盡量接觸盡可能多的點(diǎn)。

2 非標(biāo)記SERS法用于病原菌檢測(cè)

非標(biāo)記SERS方法具有較高的靈敏度和豐富的光譜特征，這些特點(diǎn)為細(xì)菌檢測(cè)提供了新的研究方向[29]?，F(xiàn)有研究缺乏SERS譜帶歸屬的匯總或相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，因此，大多數(shù)基于非標(biāo)記SERS的研究重點(diǎn)是解釋細(xì)菌的SERS并進(jìn)行SERS檢測(cè)病原菌新方法的探索。

Jarvis等通過(guò)體內(nèi)還原靠近細(xì)胞內(nèi)膜的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Au（Ⅲ），首次報(bào)道了來(lái)自細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)的SERS信號(hào)[30]。在拉曼位移為1250 cm-1處的SERS峰的產(chǎn)生與細(xì)胞膜和胞質(zhì)蛋白相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)SERS峰主要來(lái)源于細(xì)菌細(xì)胞壁的成分，如核酸、蛋白質(zhì)、多糖、碳水化合物和脂質(zhì)以及復(fù)雜的分子聚合物[31]，SERS增強(qiáng)機(jī)制中的距離依賴(lài)性也支持這一假說(shuō)。拉曼位移在 624、652、735、955、1330和1456 cm-1處的SERS譜峰主要來(lái)自細(xì)胞壁。拉曼位移在735和1330 cm-1處的SERS譜峰是腺嘌呤或單磷酸腺苷的典型特征[32]，可以更準(zhǔn)確地歸屬于腺嘌呤的平面環(huán)狀呼吸模式或來(lái)自其他含腺嘌呤分子（FAD、NAD等）以及嘌呤部分的不同產(chǎn)物[33]。拉曼位移為735和1130 cm-1處的峰歸屬于變性DNA，這也證明了Ag納米球（Ag NSs）和細(xì)菌細(xì)胞壁之間結(jié)合緊密。所有細(xì)菌在給定的光譜區(qū)域520和1050 cm-1中有相似的峰，其中某些峰的強(qiáng)度存在一些差異。細(xì)菌的SERS提供了分子結(jié)構(gòu)、細(xì)胞成分和生理狀態(tài)特征，可用于區(qū)分不同菌種或區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌[34-35]。例如，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在拉曼位移1128～1388 cm-1范圍內(nèi)，可以看出SERS的明顯差異。來(lái)源于蛋白質(zhì)CH變形的拉曼位移為1330 cm-1處的SERS峰強(qiáng)度表明革蘭陰性菌的細(xì)胞壁含有比革蘭陽(yáng)性菌更多的蛋白質(zhì)[36]。用SERS比較死細(xì)菌和活細(xì)菌時(shí)，SERS的不同可能是由于死細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的破裂所致[37]。

主要用于細(xì)菌檢測(cè)的非標(biāo)記SERS方法是通過(guò)將貴金屬納米顆粒和溶液中細(xì)菌混合或者通過(guò)在細(xì)菌附著的增強(qiáng)基底上形成一層納米粒子薄膜。只有當(dāng)基底具有可重復(fù)性并且能提供高度增強(qiáng)SERS信號(hào)時(shí)，才能成功檢測(cè)細(xì)菌。

Wang等發(fā)明了一種新型單分散Ag NSs的SERS基底，其具有由Ag納米晶體（Ag NCs）組裝形成的熱點(diǎn)，用于區(qū)分3種病原菌（大腸桿菌O157、傷寒沙門(mén)菌和金黃色葡萄球菌）以及區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌[38]。由Xu等發(fā)明的準(zhǔn)三維等離子體納米結(jié)構(gòu)陣列構(gòu)成的SERS基底，可用于快速檢測(cè)7種臨床上和環(huán)境中常見(jiàn)的副溶血性弧菌菌株。上述2項(xiàng)研究均成功地鑒定了病原菌，但沒(méi)有理想的定量結(jié)果[39]。

萬(wàn)古霉素是一種抗生素，可以通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖和萬(wàn)古霉素的羰基和胺基之間形成氫鍵，緊密結(jié)合細(xì)菌，增加細(xì)菌對(duì)納米金屬表面的黏附可以使檢測(cè)限大大提高[40]。萬(wàn)古霉素可以將一小部分細(xì)胞壁與SERS基底之間距離拉近，形成熱點(diǎn)，從而導(dǎo)致SERS信號(hào)大大增強(qiáng)[41]。萬(wàn)古霉素修飾的Ag NRs可以更容易地捕獲革蘭陽(yáng)性細(xì)菌[42]，研究發(fā)現(xiàn)萬(wàn)古霉素包被的Ag-Au基底對(duì)革蘭陰性和革蘭陽(yáng)性菌的SERS增強(qiáng)效果比沒(méi)有被萬(wàn)古霉素或頭孢他啶水合物包被的基底增強(qiáng)效果更好，還可以排除血液成分的干擾[43]。雖然基于納米金屬表面的SERS增強(qiáng)方法可以提供病原菌相對(duì)穩(wěn)定和可重現(xiàn)的SERS信號(hào)，但復(fù)雜的合成和較高的成本限制了其應(yīng)用。

與上述納米金屬表面相比，貴金屬納米顆粒更容易合成，因此應(yīng)用更加廣泛。通常使用膠體金、膠體銀與細(xì)菌簡(jiǎn)單混合進(jìn)行非標(biāo)記SERS檢測(cè)[44]，但所產(chǎn)生的混合物可能會(huì)導(dǎo)致納米顆粒在病原菌表面隨機(jī)分布，使得SRES的重現(xiàn)性差。由于革蘭陰性和革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁分別存在脂多糖或磷壁酸而帶負(fù)電，因而可以通過(guò)靜電吸引力使納米顆粒沉積在細(xì)菌細(xì)胞壁上。例如，Kahraman等報(bào)道了聚丙烯氯化銨（PAH）/Au NPs/PAH逐層結(jié)構(gòu)，其可以通過(guò)靜電相互作用高效且精確地沉積在細(xì)菌細(xì)胞壁上，用于單個(gè)細(xì)菌的SERS檢測(cè)[45]，但這一方法步驟復(fù)雜且無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量。原位合成法可以保證納米顆粒與細(xì)菌細(xì)胞壁的均勻接觸。Zhou等提出通過(guò)靜電作用在細(xì)菌細(xì)胞壁上原位合成Ag NPs，從而更好地對(duì)飲用水中的細(xì)菌進(jìn)行SERS檢測(cè)[46]。使用這種方法增強(qiáng)細(xì)菌的拉曼信號(hào)比膠體和細(xì)菌簡(jiǎn)單混合的懸浮液得到的SERS信號(hào)要強(qiáng)很多[47]，此方法對(duì)水中病原菌細(xì)胞的最低檢測(cè)限為2.5×102/mL。此外，我們發(fā)現(xiàn)Ag NPs合成后細(xì)菌的拉曼信號(hào)強(qiáng)度主要取決于細(xì)胞壁的Zeta電位。此外，我們研究了這種方法用于區(qū)分野生型菌株和抗生素耐藥突變菌株的機(jī)制，以及通過(guò)SERS圖譜對(duì)活細(xì)菌和死細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)[48]，結(jié)果表明電荷似乎只與細(xì)菌表面Ag NPs的重新合成有關(guān)，而與它們的持續(xù)附著無(wú)關(guān)。這一方法具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)物體積較小、靈敏度和選擇性高，以及良好的重現(xiàn)性，可以應(yīng)用到更復(fù)雜的樣品如食品或血液樣品中。

盡管目前通過(guò)SERS增強(qiáng)基底直接增強(qiáng)純培養(yǎng)的細(xì)菌來(lái)獲得目標(biāo)菌的SERS指紋圖譜并進(jìn)行聚類(lèi)分析的方法有很多報(bào)道，但直接對(duì)臨床樣本中的病原菌進(jìn)行快速SERS檢測(cè)的研究仍有很多困難。臨床樣本組成較為復(fù)雜，而普通SERS增強(qiáng)基底缺乏選擇性，實(shí)際樣本中的雜質(zhì)信號(hào)會(huì)嚴(yán)重干擾目標(biāo)細(xì)菌的SERS信號(hào)。針對(duì)這一難點(diǎn)，研究人員提出了一種利用廣譜生物識(shí)別分子修飾的SERS基底，從復(fù)雜樣本中分離、純化細(xì)菌后，直接檢測(cè)其SERS指紋譜信號(hào)的新方法。如2011年，王玉麟等報(bào)道了萬(wàn)古霉素修飾的固態(tài)納米銀基底可以從血液中捕獲多種病原菌[49]。2014年，何耀等利用巰基苯硼酸修飾的硅基銀基底在血液中直接捕獲并檢測(cè)了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[50]。2016年，王升啟等報(bào)道了一種利用聚乙烯亞胺修飾的金殼磁珠能夠快速捕獲、富集并直接增強(qiáng)出病原菌的拉曼信號(hào)，用該方法在牛奶等復(fù)雜溶液中檢測(cè)細(xì)菌只需15 min，檢測(cè)限為1000 CFU/mL[51]。上述基于修飾的SERS基底指紋譜檢測(cè)病原菌的方法具有快速檢測(cè)實(shí)際樣本中病原菌的潛力，但檢測(cè)靈敏度還較差（＞500 CFU/mL），并且無(wú)法區(qū)分混合菌群。

3 結(jié)語(yǔ)

以上我們總結(jié)了近年來(lái)非標(biāo)記表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)病原菌的進(jìn)展。大量研究表明，通過(guò)合理構(gòu)建基于非標(biāo)記的SERS檢測(cè)體系，將SERS技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合，即具有實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)病原菌的強(qiáng)大潛力。然而非標(biāo)記SERS檢測(cè)病原菌仍存在很多問(wèn)題。例如，納米材料的增強(qiáng)作用在不同位點(diǎn)是不同的，粒子之間距離越近，偶合和增強(qiáng)效應(yīng)就越強(qiáng)，反之增強(qiáng)效應(yīng)就越弱，因此，SERS技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵在于制備出均勻、穩(wěn)定和可重現(xiàn)性好的增強(qiáng)基底；SERS直接檢測(cè)在復(fù)雜體系中極易受到干擾信息的影響，因此，提高檢測(cè)方法的選擇性，是SERS技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際復(fù)雜檢測(cè)體系的關(guān)鍵；所獲SERS圖譜的分析目前還做不到一鍵式，需要后期處理；科研人員還須構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，使SERS成為檢測(cè)病原菌的常規(guī)項(xiàng)目，并建立相應(yīng)的病原菌數(shù)據(jù)庫(kù)以實(shí)現(xiàn)病原菌快速鑒定。