趙江華 房歡 張大偉

（1.中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；2.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，保定071000）

微生物包括細菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體，它個體微小，與人類關(guān)系密切。其涵蓋了有益和有害的眾多種類，廣泛涉及食品、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保和體育等諸多領(lǐng)域。在我國教科書中，將微生物劃分為以下8大類：細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體和螺旋體。在上述8類微生物中，能夠產(chǎn)生與我們生活息息相關(guān)的次級代謝產(chǎn)物的主要是細菌、真菌和放線菌。

生物從環(huán)境中攝取小分子營養(yǎng)物質(zhì)，合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等生命活動必須的物質(zhì)以及獲取能量的過程稱為初級代謝［1］。除了初級代謝外，微生物還能通過次級代謝活動分泌多種次級代謝產(chǎn)物，如維生素等具有重要價值的活性物質(zhì)。不同于初級代謝，次級代謝通常由營養(yǎng)物質(zhì)、生長速度、反饋控制、酶失活和誘導等因素控制，并非生命體必須進行的活動。但兩者并不是毫無聯(lián)系，它們之間互相作用，共同調(diào)節(jié)生命活動。初級代謝是生命活動的基礎(chǔ)，其產(chǎn)物可作為次級代謝的原料，次級代謝產(chǎn)物如抗生素能夠抑制其他微生物的生長，所以次級代謝能夠調(diào)節(jié)初級代謝活動［2］。常見的次級代謝產(chǎn)物有抗生素、激素、毒素、生物堿及維生素等［3］。

1 次級代謝產(chǎn)物的來源

1.1 細菌來源次級代謝產(chǎn)物

除了植物，細菌占了地球上生物量的大部分。它們隨處可見，盡管某些物種只在特定的生態(tài)位中繁衍生息［4］。長期以來，細菌發(fā)酵一直被用于制造具有營養(yǎng)、農(nóng)化和醫(yī)藥價值的天然產(chǎn)品。如黏細菌，它產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物無論是在化學結(jié)構(gòu)還是生物活性上都具有豐富的多樣性。代謝產(chǎn)物的多樣性及廣譜活性，在開發(fā)藥物方面具有巨大的潛力。黏細菌的抗生素產(chǎn)生菌的比例高于目前已知的產(chǎn)生抗生素最多的放線菌［5］。

1.2 真菌來源次級代謝產(chǎn)物

真菌具有生物多樣性，已描述的真菌種類約 9.7萬余種，僅占 6%左右?，F(xiàn)今已知的具有生物活性的微生物次級代謝產(chǎn)物中，有50%是絲狀真菌產(chǎn)生的［6］。包括人們最熟悉的青霉素和頭孢菌素等抗生素、免疫抑制劑環(huán)孢菌素A、降血糖藥物阿卡波糖以及降血脂藥物洛伐他汀等。此外，真菌還能夠產(chǎn)生大量的細胞毒物質(zhì)，其中包括一些強毒性化合物，如單端多孢霉烯以及黃曲霉毒素等真菌毒素［7］。眾所周知，黃曲霉毒素能夠致癌，嚴重威脅人類的生命健康，但是人類可以通過研究其致癌機理，發(fā)現(xiàn)潛在的抗腫瘤藥物。如具細胞毒活性的二酮哌嗪類化合物可作為治療腫瘤的藥物［8］。

1.3 放線菌來源次級代謝產(chǎn)物

微生物產(chǎn)生的具有生物活性的天然次級代謝產(chǎn)物，大都基于對放線菌的挖掘。放線菌次級代謝產(chǎn)物種類豐富，約占已報道微生物來源生物活性物質(zhì)的50% 左右，這些物質(zhì)根據(jù)化學結(jié)構(gòu)可分為 β-內(nèi)酰胺類、多肽類、糖肽類、核苷類及聚酮類等［9］，具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、殺蟲及免疫抑制劑和免疫激活劑等的功效，在醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、獸業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域有廣泛地應(yīng)用［10］。

雖然對次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生菌已經(jīng)進行了多方面的挖掘，但迄今為止我們發(fā)現(xiàn)的數(shù)量只是冰山一角，況且利用傳統(tǒng)的辦法已經(jīng)很難發(fā)現(xiàn)新的產(chǎn)物，在提高產(chǎn)物產(chǎn)量方面也遇到了瓶頸。有兩個因素阻礙了新化合物面世：（1）能夠在人工培養(yǎng)條件下存活的微生物為數(shù)不多，目前在實驗室培養(yǎng)條件下成功的僅占0.1%-1%［11］；（2）在普通培養(yǎng)條件下，大多數(shù)次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇（BGCs）不能表達。如果這些潛在的生物合成開關(guān)被打開，就有望發(fā)現(xiàn)更多新的活性產(chǎn)物，新藥研發(fā)會有一個跳躍式發(fā)展［12］。

2 研究微生物次級代謝產(chǎn)物應(yīng)用到的方法策略

2.1 次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇異源表達

阻礙次級代謝產(chǎn)物出現(xiàn)的因素之一就是標準實驗室生長條件，因此微生物代謝組尚有很大的開發(fā)空間［13］。2018年，Harvey等［14］開發(fā)了異源表達合成生物學平臺，用于釀酒酵母中真菌生物合成基因及其編碼代謝物的快速、可擴展表達。通過高通量基因組測序，對潛在的次級代謝產(chǎn)物合成途徑有了一定認識。通過異源表達途徑重建與基因工程相結(jié)合，可以發(fā)現(xiàn)新的化合物，闡明產(chǎn)物合成途徑，優(yōu)化產(chǎn)品產(chǎn)量。大腸桿菌、酵母菌、絲狀真菌作為模式菌株，有完善的遺傳工具箱，是高效的異源宿主［15］。在Harvey等［14］的研究中，將41個不同來源的BGC在釀酒酵母中表達，其中22個（54%）來自不同的子囊菌和擔子菌，產(chǎn)生了可檢測的非釀酒酵母特有的化合物。這個平臺使酵母的異源表達方法向前邁進了一大步，并可能為發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物打開大門。通過異源表達，可以更清楚的了解產(chǎn)物的代謝過程，為產(chǎn)物產(chǎn)量的優(yōu)化和獲取更加有價值的次級代謝產(chǎn)物指明了方向［16］，其優(yōu)點主要包括：（1）繞過了難以培養(yǎng)或無法培養(yǎng)的菌株；（2）將每種BGCs與其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物掛鉤；（3）有利于對宿主進行基因操作、優(yōu)化后期的發(fā)酵條件，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)［17］。

2.1.1 宿主細胞遺傳修飾和改造 異源沉默基因簇表達時，為防止宿主環(huán)境不適合外源基因的表達，有必要對宿主進行遺傳修飾改造［18］。和公司裁員大概是一個道理，對基因組進行刪減，就像是給細胞減負，這樣才能達到特定次級代謝產(chǎn)物的生物合成水平。本身的基因?qū)ν庠椿虼氐挠绊懡档?，可為沉默基因簇的表達提供理想條件［19］。當大腸桿菌或酵母用作真核生物次級代謝產(chǎn)物生物合成基因的表達宿主時，為防止宿主元件的缺失，需要對宿主菌株進行工程設(shè)計，以產(chǎn)生 4-磷酸泛乙烯基轉(zhuǎn)移酶（PPTase），特別是 PKSs 和 NRPSs 的表達。絲狀真菌宿主具有內(nèi)源性 PPTase 活性，為PKSs 和NRPSs的ACP和PCP結(jié)構(gòu)域提供修復(fù)基，因此它們不需要外源性PPTase基因［15］。

2.1.2 對基因簇的加倍和其他調(diào)控 在對卡那霉素高產(chǎn)菌株的研究中，工作人員發(fā)現(xiàn)多拷貝的卡那霉素基因簇，這種多拷貝的方法是提高產(chǎn)量的有效手段［20］。除了基因簇加倍，還可以采取轉(zhuǎn)座子干擾、紫外線或化學誘變或單基因缺失文庫的手段，用BGC刪除策略構(gòu)建基因缺失文庫，然后研究這個敲除文庫中的代謝圖譜。還有敲除抑制次級代謝產(chǎn)物表達的基因、過度表達簇特異性轉(zhuǎn)錄激活因子或全局性調(diào)控因子［15］、組成型表達或過表達同源正調(diào)控基因［21］等這些途徑都有助于發(fā)現(xiàn)更隱秘或沉默的次級代謝物。

2.1.3 宿主細胞與生物合成基因簇適配性改造 絲狀真菌的異源表達具有一定的挑戰(zhàn)性，寄主可能受到插入簇的影響，導致代謝物譜發(fā)生變化，或插入簇與原簇之間產(chǎn)生串擾，從而難以識別正確的新次級代謝產(chǎn)物。為了使異源簇表達，通常將內(nèi)源次級代謝產(chǎn)物BGCs沉默，或?qū)⑵淝贸蛞种破浔磉_。但是，這一舉措會使異源簇與宿主不適配的問題更突出，通常不能產(chǎn)生理想的產(chǎn)物或產(chǎn)量很低。主要原因是基因簇未正常轉(zhuǎn)錄，直接過表達關(guān)鍵基因、更換活性適當?shù)膯幼?，可精細調(diào)控關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄量使基因簇正常表達。也可引入供體基因增加前體。此外，異源表達過程中有時不會正確利用底物，引起資源浪費，限制合成能力，導致產(chǎn)量降低。引入糾錯因子可以阻斷宿主細胞中的某些基因編碼酶對異源次級代謝產(chǎn)物的錯誤修飾，可使產(chǎn)物復(fù)性［22］。

2.2 轉(zhuǎn)錄、翻譯水平進行調(diào)控

2.2.1 核糖體工程 野生型變鉛青鏈霉菌在正常情況下不會生產(chǎn)抗生素，但是當環(huán)境因素改變導致其核糖體蛋白S12突變后，便能生產(chǎn)大量藍色的放線紫紅素［23］。通過調(diào)節(jié)核糖體蛋白或rRNA可以顯著改變細菌基因表達，最終導致不活躍（沉默）基因的激活。因此，我們的最終目的是開發(fā)“核糖體工程”，以合理的方法充分激發(fā)細菌的能力。Ochi研究組［24］引出了核糖體工程的概念：微生物在資源耗盡時會產(chǎn)生突變，形成耐藥性菌株。該菌株核糖體或RNA聚合酶改變，會影響蛋白的表達，最終的影響是出現(xiàn)新的代謝產(chǎn)物或者原有代謝物的分泌量提高。核糖體和 RNA 聚合酶是蛋白質(zhì)合成過程中的兩個重要部分，如果它們發(fā)生了突變將會對次生代謝物的合成帶來深刻的影響［25］。劉華華等［26］通過核糖體工程技術(shù)成功篩選獲得一株耐鏈霉素的阿維拉霉素高產(chǎn)突變菌株S.viridochromogenes gs 77-54，而且對其遺傳穩(wěn)定性能進行測驗，結(jié)果表現(xiàn)出很好地穩(wěn)定性。

2.2.2 干擾蛋白質(zhì)降解系統(tǒng) 催化反應(yīng)的蛋白包括一些轉(zhuǎn)錄因子不能持續(xù)發(fā)揮作用，它們都會經(jīng)蛋白酶途徑失活，這一過程依賴泛素標記的靶蛋白，需要多蛋白COP9信號復(fù)合物。Jennifer等［27］將構(gòu)巢曲霉作為研究對象，敲除編碼COP9第5亞基的csnE基因，對突變體的次級代謝產(chǎn)物進行了研究。研究結(jié)果顯示：有聚酮合成酶的基因被激活并且產(chǎn)生了它的代謝產(chǎn)物DHMBA，除此之外還從突變菌株中發(fā)現(xiàn)了苔色酸。實驗表明，敲除蛋白失活過程中編碼關(guān)鍵蛋白的基因可以阻斷代謝過程中蛋白質(zhì)的降解，可以激活沉默的基因表達。通過他們的實驗可以預(yù)見，還有更多新的沉默基因以及次級代謝產(chǎn)物有待發(fā)現(xiàn)［28］。

2.2.3 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控 鏈霉菌產(chǎn)生氣生菌絲體和次級代謝產(chǎn)物的過程由微妙而精確的監(jiān)管系統(tǒng)控制。與真菌一樣，細菌代謝過程中最常見的是在轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)節(jié)，在這一過程中，起主要作用的是轉(zhuǎn)錄因子，它們通過結(jié)合DNA上特殊的序列來抑制或激活特定基因的轉(zhuǎn)錄［29］。轉(zhuǎn)錄因子對基因轉(zhuǎn)錄的起始進行調(diào)控，按照調(diào)控作用劃分，轉(zhuǎn)錄因子可分為正調(diào)控因子和負調(diào)控因子。正調(diào)控因子對基因簇的轉(zhuǎn)錄起到促進作用，而負調(diào)控因子是相關(guān)基因簇的“絆腳石”，使基因簇關(guān)閉［30］。為了研究 HOS2型酶在曲霉中的作用，Angelo等［31］刪除了 HosA 的編碼序列。將具有缺失結(jié)構(gòu)的單一基因組整合的hosA缺失菌株的孢子接種到瓊脂平板上，并將分別裝載有濃度增加的抗真菌物質(zhì)的條帶施加到平板上。結(jié)果顯示，HosA 缺失菌株在瓊脂平板上和液體培養(yǎng)中有顯著的色素沉著，表明 HosA 可能作為次級代謝產(chǎn)物的阻遏物。為了證明 HosA 在 烯酸（OA）生物合成基因簇調(diào)控中的作用，研究人員將 HosA 缺失株培養(yǎng) 24、36、48 和 60 h，用 RNA 雜交探針對烯酸生物合成基因簇聚酮合酶基因 orsA 進行 Northern雜交分析。結(jié)果表明HosA 活性抑制烯酸生物合成。但是，與烯酸相比，hosA 缺失對 青霉素（PN）產(chǎn)生顯著而相反的結(jié)果。因此，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子也是一種常用的抑制或激活次級代謝產(chǎn)物的策略。

2.3 表觀遺傳調(diào)控

在DNA 序列不變的情況下改變基因表達或使其沉默，這種策略稱表觀遺傳調(diào)控。由于真核生物具有染色體結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)纏繞而導致生物合成基因簇處于沉默狀態(tài)，通過打開染色體的螺旋結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)處于“蓬松”狀態(tài)，進而解除生物合成基因簇的“沉默禁令”。LaeA就通過染色體重塑解除沉默禁令的信號。LaeA攜帶S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）結(jié)合域，SAM結(jié)構(gòu)域識別甲基轉(zhuǎn)移酶的特征，將甲基從普遍存在的SAM轉(zhuǎn)移到氮原子、氧原子或碳原子。這種反應(yīng)經(jīng)常用于所有門的生物體中，不僅修飾蛋白質(zhì)，還修飾DNA、RNA和小分子。作為一種全局性調(diào)控因子，LaeA廣泛存在于絲狀真菌中。除了采用分子遺傳學手段控制LaeA的表達，目前經(jīng)常使用抑制劑抑制表觀遺傳修飾酶的表達［32］。Willams等［33］利用化學表觀遺傳學方法，在枝孢菌的培養(yǎng)中加入5-氮胞苷，進而得到氧化脂質(zhì)。Henrikson 等［34］在黑曲霉的發(fā)酵過程中添加脫乙酰酶抑制劑SAHA，意外獲得了新的化合物 nygerone A。對黑曲霉進行研究發(fā)現(xiàn)，36%的黑曲霉BGCs的轉(zhuǎn)錄被脫乙酰酶抑制劑SAHA顯著上調(diào)，說明染色質(zhì)重塑在激活沉默基因簇中的潛力［35］。

2.4 代謝調(diào)控技術(shù)

代謝調(diào)控就是通過對DNA進行有目的改造，對體內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)進行精密調(diào)控，實現(xiàn)菌體性能的提高、其他大分子裝配等的過程。為提高鏈霉菌中聚酮類化合物的效價，研究人員設(shè)計了一個動態(tài)降解三酰甘油（ddTAG）的策略，來高效利用三酰甘油以增加聚酮的生物合成。將sco6196基因置于cumate誘導啟動子的控制下，以生成ddTAG模塊，從而能夠選擇性地控制TAG降解的時間和強度。將ddTAG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到M145以產(chǎn)生菌株M145-DT，發(fā)現(xiàn)使用誘導劑調(diào)節(jié)TAG降解可增加放線菌素的效價。對這一現(xiàn)象的合理解釋是TAG的合理流通可以提供并將更多的碳通量轉(zhuǎn)向放線菌素合成。ddTAG的應(yīng)用使阿維菌素B1a在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵中的效價提高了50%，達到9.31 g/L［36］。在鏈霉菌中，脂肪酸和聚酮類化合物的合成共用前體乙酰CoA，因此會發(fā)生底物的競爭。有研究表明，在鏈霉菌中有兩種中心碳代謝酶通過復(fù)制被擴增，它們分別是磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，并且對著兩種酶進行詳細的遺傳和生化分析，發(fā)現(xiàn)這兩種酶的缺失突變體表現(xiàn)出抗生素生產(chǎn)過剩的表型。這表明初級代謝的精細平衡受到干擾會影響前體的供應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)。因此，通過代謝干擾可增強主要代謝底物的供應(yīng)，脂肪酸生物合成的抑制被作為一種促進聚酮類次級代謝產(chǎn)物合成的途徑［37］。上述兩個例子，都是通過調(diào)控代謝過程，改變了碳的流通，將碳源集中分配，在保證不破壞其他關(guān)鍵途徑的前提下，以提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量為最終目標。

2.5 調(diào)整培養(yǎng)條件

微生物易受培養(yǎng)條件的影響，如培養(yǎng)基組成、溫度、pH 值、金屬離子、氧氣濃度、鹽度、培養(yǎng)狀態(tài)、生物合成前體等，這些因素的調(diào)整必定會引起酶活性的改變，可能導致與之相關(guān)的次級代謝物多樣性的改變。因此在微生物賴以生存的培養(yǎng)基上進行研究，就能產(chǎn)生新類型的次級代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)或者已知次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量增加的結(jié)果。一株海洋衍生菌株 Ascotricha sp.ZJ-M-5 在由海鹽組成的富營養(yǎng)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一種新的三萜類化合物（119）和一種新的環(huán)烯醚衍生物（120）。然而，在改良的 Czapek-Dox 培養(yǎng)基中檢測到3種新的石竹烯衍生物（121-123），而在沒有 Mg2+的發(fā)酵液中沒有化合物122［38］。這種方法相對經(jīng)濟簡單但結(jié)果卻有多種可能，起到的是“牽一發(fā)動全身”的作用，不能確定因某一條件的改變引起的基因簇的變化，盲目性強。因此對后面比較分析代謝譜造成困難，對基因組信息有缺漏或沒有測序的次生代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)有幫助。低濃度抗生素、信號分子的添加［39］也是從這種方法中衍生出來的。

2.6 微生物共培養(yǎng)

在一種培養(yǎng)基中，一個菌株與另一個菌株之間的關(guān)系可能是競爭性的、對抗性的或友好的。兩個或兩個以上菌株的共培養(yǎng)通常對提高已知化合物的產(chǎn)量或積累在無菌培養(yǎng)中未檢測到的隱匿化合物具有積極作用。土壤放線菌 S.coelicolor 與珊瑚球菌共培養(yǎng)時，可顯著提高紅色化合物十一肽的產(chǎn)量。一株陸地細菌Tsukamurella pulmonis TP-B0596 與一株鏈霉菌 NZ-6 共培養(yǎng)，刺激了3種前所未有的雙環(huán)和三環(huán)大內(nèi)酰胺的新代謝物的產(chǎn)生。兩種海綿源放線菌Nocardiopsis sp.RV163和放線菌EG49 的共培養(yǎng)，誘導了10種化合物，包括二酮哌嗪、安古霉素和β-卡波林衍生物，而在單一培養(yǎng)中僅分離出3種天然產(chǎn)物。一種真菌菌株土曲霉與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時，可產(chǎn)生兩種新的莽草酸類似物和4種新的丁烯內(nèi)酯衍生物，而這些化合物均未在無菌培養(yǎng)基中被發(fā)現(xiàn)［38］。微生物為了有限的資源，如空間或營養(yǎng)物而相互競爭。某些細菌可產(chǎn)生對其他微生物有毒的分子，使自己具有競爭優(yōu)勢。這些有毒分子通常被稱為抗生素，然而，一些細菌可利用抗生素作為化學信號來調(diào)節(jié)它們的活動進而產(chǎn)生其他類型的產(chǎn)物［40］。雖然這種方法有效，但是同OSMAC策略一樣也具有一定的盲目性，兩株菌相互作用，其應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)作用在彼此身上并且體現(xiàn)在最后的產(chǎn)物上，我們不能摸清楚是哪種分子發(fā)揮作用。

3 結(jié)語

微生物次級代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)療等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，具有很大的商業(yè)價值，因此提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量將會創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟價值，挖掘新的次級代謝產(chǎn)物也會對新藥的開發(fā)起到極大的推動作用。生物學的發(fā)展，既豐富了我們的理論依據(jù)，也為我們帶來了新技術(shù)和新工具，微生物基因組測序和相關(guān)的生物信息工具的發(fā)展讓我們看到了挖掘新的次級代謝產(chǎn)物的前景。若這些沉默的基因簇全部被激活，次級代謝產(chǎn)物的數(shù)量將會以指數(shù)形式進行增長。上述挖掘新的次級代謝產(chǎn)物、提高微生物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量的策略中，歸根結(jié)底都是為了激活沉默的微生物次級代謝產(chǎn)物BGCs。只不過有的方法起到的是全域性調(diào)節(jié)，有的方法是針對具體的基因進行調(diào)控。近來，代謝組學迅速發(fā)展，我們對微生物體內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)認識的越來越清楚。了解從初級代謝到次級代謝的轉(zhuǎn)變可以幫助制定策略，通過調(diào)控代謝過程使資源更多、更集中的流向目標產(chǎn)物。未來可以將傳統(tǒng)的代謝工程技術(shù)與更復(fù)雜的合成代謝工程相結(jié)合，運用系統(tǒng)生物學和進化工程可極大地促進所需和有價值的代謝物的產(chǎn)生?；蚪M測序和DNA合成成本的降低，以及用于BGCs克隆和重構(gòu)的許多有效遺傳工具出現(xiàn)，基因編輯技術(shù)迅速崛起，CRISPR-Cas9系統(tǒng)正在成為一個新興的基因組編輯平臺，結(jié)合生物信息學、合成生物學、代謝組學等技術(shù)，通過對細胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的深刻認識，相信微生物次級代謝產(chǎn)物BGCs的挖掘在后基因組時期將會進入一個黃金時代。