王 博 李恩萍 楊長春 史天云 陳 鶴 徐方方 (南陽市第一人民醫(yī)院婦科，南陽 473000)

宮頸癌(cervical cancer，CC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在我國CC也是癌癥相關死亡的最常見原因之一[1]。近年來，隨著女性過早發(fā)生性行為、有多個性伴侶及高危型人乳頭瘤病毒攜帶者的人數(shù)增加，CC發(fā)病率持續(xù)上升，且呈現(xiàn)年輕化的趨勢[2]。順鉑(Cisplatin，DDP)是目前化療的常用藥物，研究報道DDP對CC細胞有增殖抑制和凋亡誘導作用[3]。DDP在殺滅腫瘤細胞的同時對患者的正常生理功能和免疫系統(tǒng)也具有較大的負面影響[4]。臨床上常使用其他的藥物聯(lián)合DDP共同使用，實現(xiàn)CC對DDP的化療敏感性。漢黃岑素是黃岑有效成分之一，具有抗病毒、抗腫瘤及保護神經(jīng)的生物活性[5]。漢黃岑素也可以抑制肺癌細胞的增殖和分化并促進其凋亡[6]。研究表明黃芩素可以顯著降低細胞侵襲浸潤能力[7]。但目前漢黃岑素通過調(diào)節(jié)信號通路對CC化療敏感性的影響研究較少。本文旨在研究漢黃岑素通過調(diào)節(jié)P53信號通路增強CC對DDP的化療敏感性，以期了解黃岑素通過調(diào)節(jié)P53信號通路增強CC對DDP的化療敏感性影響的作用機理，從而為CC治療提供一定的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要細胞 宮頸癌細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑與儀器 漢黃岑素(純度>98%)購自成都康輝生物科技有限公司；Caspase-3、Bcl-2、Bax抗體購自武漢華聯(lián)科技有限公司；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司；LC3抗體購自美國Sigma公司；cytC抗體購自Santa Cruze Biotechnology 公司；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ試劑盒購自江萊生物有限公司；Ki67、PCNA抗體購自北京傲銳東源生物科技有限公司；Beclin1、 P62抗體購自Sino Biolocgical公司；磷酸鹽緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自廣州威佳科技有限公司；DMEM基礎培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技公司；青霉素鈉購自哈藥集團制藥總廠。

細胞培養(yǎng)箱購自美國Forma公司；低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；光學顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；熒光分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司；流式細胞儀購自賽默飛世爾科技有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1分組干預 分別使用0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μmol/L的漢黃岑素處理正常宮頸細胞系建立DDP敏感性的CC細胞株，并檢測IC50后將細胞分為：空白對照組、貝伐單抗組、順鉑組、低劑量漢黃岑素組、中劑量漢黃岑素組、高劑量漢黃岑素組、P53抑制劑組和漢黃岑素+P53抑制劑組，其中貝伐單抗組使用2.5 μg/ml的貝伐單抗處理；順鉑組使用10 mg/L 的DDP處理；低劑量漢黃岑素組使用DDP 10 mg/L+WG 5 μmol/L處理；中劑量漢黃岑素組使用DDP 10 mg/L+WG 10 μmol/L處理；高劑量漢黃岑素組使用DDP 10 mg/L+WG 20 μmol/L處理；P53抑制劑組使用DDP 10 mg/L+P53抑制劑 Pifithrin-α處理；漢黃岑素+P53抑制劑組使用DDP 10 mg/L+WG20 μmol/L+P53抑制劑 Pifithrin-α處理。

1.2.2細胞培養(yǎng) 將宮頸癌細胞株培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中，保存在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.3流式細胞儀分析檢測細胞凋亡 分別將各組細胞培養(yǎng)24 h后使用胰酶消化，在4℃ 3 500 g離心5 min 收集細胞；收集細胞后加入100 μl Binding Buffer重懸細胞并加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕混勻；室溫避光孵育15 min并加入400 μl Binding Buffer，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4Western blot 檢測蛋白表達水平 取對數(shù)期細胞，吸除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基保存于滅菌離心管中。1 200 r/min離心10 min后加入裂解液重懸細胞，放置于冰中裂解30 min，再次以1 200 r/min離心10 min，加入200 μl的Loading Buffer 緩沖液，100℃煮沸10 min；使用BCA法測定蛋白濃度后，使用SDS-PAGE電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜后放入 TBST 溶液中緩慢搖動洗膜5 min，再將 PVDF 膜放入配制好的一抗液中孵育，室溫下緩慢搖動30 min后放入4℃恒溫箱中過夜。取出后使用TBST洗滌3遍后放入二抗反應液中室溫孵育2 h；封閉液∶二抗為 2 000∶1；曝光后以GADPH為內(nèi)參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值為相對蛋白表達水平。

1.2.5免疫熒光檢測自噬情況 取對數(shù)生長期CC細胞，調(diào)整細胞濃度為2.5×105個/ml，2 ml接種于6孔板，37℃,5%CO2條件下，過夜培養(yǎng)(約16 h)。按照 LC3熒光試劑盒說明書加入固定液固定10 min，棄掉固定液，PBS洗3次，加入免疫染色液，室溫封閉1 h，加入DAPI染液，室溫染色5 min，洗滌液洗滌2次，加入抗淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計學方法 本研究數(shù)據(jù)分析和作圖采用的軟件為SPSS22.0和GraphPad Prism5，使用單因素方差分析，當組間差異存在統(tǒng)計學意義時，采用SNK方法進行進一步的比較；使用單因素方差分析時，若P<0.05則表明數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1漢黃岑素對宮頸癌細胞生長情況的影響 由圖1A可以看出，隨著使用漢黃岑素的濃度增加CC細胞生存率顯著降低，且當漢黃岑素濃度超過25 μmol/L 時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；由圖1B可以看出，DDP敏感性的CC細胞株IC50為50 mg/L；由圖1C可以看出，相比空白對照組，貝伐單抗組CC細胞生存率顯著下降(P<0.05)，相比順鉑組，低劑量漢黃岑素組、中劑量漢黃岑素組CC細胞生存率顯著下降(P<0.05)，相比順鉑組，高劑量漢黃岑素組CC細胞生存率顯著下降(P<0.01)。由圖1D、E可以看出，相比空白對照組，貝伐單抗組CC細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，相比順鉑組，低劑量漢黃岑素組、中劑量漢黃岑素組CC細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，相比順鉑組，高劑量漢黃岑素組CC細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)。

2.2漢黃岑素對宮頸癌細胞凋亡情況的影響 由圖2A可以看出，相比空白對照組，貝伐單抗組CC細胞凋亡顯著增加，相比順鉑組，使用漢黃岑素處理各組CC細胞凋亡顯著增加；由圖2B可以看出，相比空白對照組，貝伐單抗組CC細胞Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3、cytC蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；相比順鉑組，低劑量漢黃岑素組Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3、cytC蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；相比低劑量漢黃岑素組，中劑量漢黃岑素組Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3、cytC蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；相比中劑量漢黃岑素組，高劑量漢黃岑素組Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3、cytC蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

2.3漢黃岑素對宮頸癌細胞自噬情況的影響 由圖3A可以看出，相比空白對照組，貝伐單抗組CC細胞熒光強度顯著增強；相比順鉑組，低劑量漢黃岑素組、中劑量漢黃岑素組和高劑量漢黃岑素組CC細胞熒光強度顯著增強。由圖3B可以看出，相比空白對照組，貝伐單抗組CC細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1水平顯著升高(P<0.05)，P62顯著降低(P<0.05)；相比順鉑組，低劑量漢黃岑素組CC細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1水平顯著升高(P<0.05)，P62顯著降低(P<0.05)；相比低劑量漢黃岑素組，中劑量漢黃岑素組CC細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1水平顯著升高(P<0.05)，P62顯著降低(P<0.05)；相比中劑量漢黃岑素組，高劑量漢黃岑素組CC細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1水平顯著升高(P<0.05)，P62顯著降低(P<0.05)。

圖1 漢黃岑素對宮頸癌細胞生長情況影響

圖2 漢黃岑素對宮頸癌細胞凋亡情況的影響

圖3 漢黃岑素對宮頸癌細胞自噬情況的影響

Fig.3 Effects of Wogonin on autophagy of cervical cancer cells

Note: A.The results of immunofluorescence detection；B.The expression of autophagy-related protein.Compared with control group,**.P<0.01；compared with DDP(10 mg/L) group,#.P<0.05,##.P<0.01.

2.4不同濃度漢黃岑素對宮頸癌細胞的影響 由圖4A、B可以看出，相比順鉑組，使用5、10、20 μmol/L漢黃岑素處理各組P53蛋白表達顯著降低(P<0.05)，相比順鉑組，使用P53抑制劑組，P53蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與P53抑制劑組相比，漢黃岑素+P53抑制劑組P53蛋白表達顯著升高(P<0.05)；由圖4D、E、F可以看出，相比順鉑組，高劑量漢黃岑素組CC細胞存活率顯著下降(P<0.05)，CC細胞凋亡率、單個細胞內(nèi)LC3+熒光點數(shù)顯著升高(P<0.05)；相比P53抑制劑組，漢黃岑素+P53抑制劑組CC細胞存活率顯著下降(P<0.05)，CC細胞凋亡率、單個細胞內(nèi)LC3+熒光點數(shù)顯著升高(P<0.05)。

圖4 不同濃度漢黃岑素對宮頸癌細胞影響

3 討論

細胞的增殖和分化受到相關蛋白調(diào)控，目前研究較多的調(diào)控細胞增殖的蛋白包括：增殖細胞核抗原(PCNA)和增殖細胞周期相關核抗原(Ki67)。Boehm等[6]研究表明PNCA是細胞增殖分化的重要蛋白之一。牛建新等[7]研究表明：PNCA指數(shù)越高，細胞的分裂增殖越快，最終會讓細胞獲得無限增殖的能力并使細胞在形態(tài)和結(jié)構(gòu)機能上改變，達到促進細胞增殖的作用。Ki67是一種細胞核內(nèi)與細胞分裂增殖相關的蛋白抗原，其表達水平反映細胞增殖能力。石小燕等[8]研究表明：Ki67的表達與細胞增殖密切相關，是調(diào)節(jié)細胞周期的重要組成部分。本研究發(fā)現(xiàn)：使用漢黃岑素處理后CC細胞的Ki67、PCNA蛋白表達水平顯著降低，且隨著漢黃岑素處理濃度的增加Ki67、PCNA蛋白表達水平下降的越顯著。說明漢黃岑素可以通過降低細胞增殖相關蛋白水平，達到降低抑制CC細胞的增殖，吳克等[9]研究表明：抑制Ki67、PCNA蛋白表達可以有效抑制CC細胞的增殖，與本研究得出的結(jié)論相一致。

抑制CC的發(fā)展除了抑制CC細胞的增殖，同時促進其凋亡也是重要的方式之一。細胞凋亡是一種有序或程序性的細胞死亡(programmedcell death，PCD)方式[10]，這種程序性死亡是受相關基因調(diào)控的細胞主動性死亡過程[11]。其中Caspase是細胞凋亡的核心，Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子[12]。賈曉鵬等[13]通過前列腺腺癌細胞實驗分析得出：Caspase-9基因處于Caspase 家族激活基因的頂端，是Caspase家族中最常見的凋亡啟動子，通過自身的裂解使得 proCaspase-3 產(chǎn)生有活性的 Caspase-3。這種有活性的 Caspase-3是執(zhí)行凋亡的基因，主要作用機理是通過剪切另外的 Caspase 底物引起級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。細胞凋亡的調(diào)控因子較多，不僅有 Caspase 家族，Bcl-2 家族也是一種常見的凋亡控制基因。Bcl-2 家族中主要是由Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達量決定細胞是否凋亡[14-16]。Bax和Bcl-2表達呈相反趨勢，當Bcl-2表達下降時 Bax 表達上升，此時會促進細胞的凋亡；當Bcl-2 表達升高，而 Bax 表達降低時，則會抑制細胞的凋亡。本實驗中可以看出，使用漢黃岑素處理后，CC細胞Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高，說明CC細胞的凋亡受到了促進，這可能是漢黃岑素通過促進促凋亡蛋白的表達，抑制抑凋亡蛋白的表達而實現(xiàn)的。張衛(wèi)霞等[17]研究表明：通過抑制Bax 表達、促進Bcl-2和Caspase-3的表達可以促進CC細胞的凋亡，與本研究得出的結(jié)論相一致。

控制癌細胞的發(fā)展除了抑制其增殖促進其凋亡外，調(diào)控其自噬(Autophagy)也是重要途徑之一。自噬又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，是真核細胞為了維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種正常生理活動[18]。溶酶體參與的細胞自噬可以被缺氧和化療藥物等抑制，自噬行為可以將細胞內(nèi)老化或失去功能的長半衰期蛋白和細胞器清除。真核細胞的生命免疫應答、衰老、神經(jīng)退化和癌癥的發(fā)生均需要自噬的參與。仇志富等[19]研究表明在自噬復合物中，Beclin-1是核心組成部分，可以對自噬反應的發(fā)生進行調(diào)節(jié)和控制。吳偉等[20]研究表明當小鼠體內(nèi)缺失了 Beclin-1 雜合之后，就會引發(fā)淋巴瘤、肝癌以及自發(fā)性肺癌，證明了腫瘤形成可通過自噬反應進行抑制。P53 是一種泛素結(jié)合蛋白，這種蛋白與蛋白質(zhì)的泛素化密切相關。P53可以參與細胞信號轉(zhuǎn)導調(diào)控及自噬過程[19]。在自噬過程中，P53 與泛素化的蛋白質(zhì)結(jié)合，再與定位于自噬小體內(nèi)膜上的 LC3Ⅱ蛋白形成復合物，在自噬溶酶體內(nèi)降解。細胞出現(xiàn)自噬時，在細胞質(zhì)中 P53 蛋白不斷被降解，自噬活性減弱或者細胞存在自噬功能缺陷時，P53蛋白會在細胞質(zhì)中不斷累積。陳飛等[20]研究表明：P53 是反映自噬活性的標記蛋白之一，P53含量越高細胞內(nèi)自噬水平較低，其含量間接反映自噬小體清除水平。本研究發(fā)現(xiàn)：使用漢黃岑素處理后，CC細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1水平顯著升高，P53顯著降低。說明CC細胞內(nèi)的自噬程度增加。殷雷等[21]研究表明，提高癌細胞的自噬可以提高癌細胞對化療藥物的敏感性，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述漢黃岑素可以通過調(diào)節(jié)P53信號通路增強CC細胞的自噬和凋亡，抑制其增殖，實現(xiàn)增強CC對DDP的化療敏感性，且在一定劑量范圍內(nèi)對漢黃岑素呈劑量依賴性。后續(xù)可以進行小鼠體內(nèi)試驗，進一步驗證黃岑素通過調(diào)節(jié)P53信號通路增強CC對DDP的化療敏感性。