張曉愉 張昆鵬 王建民 趙曉輝 (邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,邢臺 054000)

帕金森(Parkinson′s disease,PD)又稱為震顫麻痹，是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，多發(fā)于老年人[1,2]。PD主要是由于黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性、壞死引起，PD患者腦組織病理改變表現(xiàn)為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元嚴重缺失，現(xiàn)階段尚無徹底治療的方法[3,4]。圣草次苷又稱為圣草枸楷苷，是一種常見的黃銅類中藥，可減輕氧化應激損傷、降血脂，其抗氧化能力強于橙皮苷、柚皮苷等，同時可以降低血脂[5]。本實驗給大鼠注射MPTP制成PD模型，并使用圣草次苷處理，旨在研究圣草次苷對PD疾病的影響，以期了解圣草次苷對PD治療的作用機理，從而為PD的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級3周齡SD小鼠75只，購自廣東醫(yī)學院實驗動物中心，粵監(jiān)證字 2004A029號，所有小鼠分15個籠子飼養(yǎng)，每個籠子5只。所有小鼠均在本院動物中心實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對濕度50%～65%，該實驗經(jīng)過動物倫理委員會批準同意。

1.1.2藥物與試劑 圣草次苷(產(chǎn)品編號：E52220；CAS：13463-28-0；純度>98%；分子式：C27H32O15，水溶性)購自上海吉至生化科技有限公司；甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶購自百靈威科技有限公司；蘇木素、伊紅購自武漢博士得生物有限公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH)檢測試劑盒均購自上海恒遠生物科技有限公司；Caspase-3抗體(批號：31A1067201806)購自碧云天公司；Caspase-9抗體(貨號：sc-56076；批號：20190401)、Bcl-2抗體(貨號：sc-7382；批號：20190201)、Bax抗體(貨號：sc-7480；批號：20190301)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；誘生型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)ELISA試劑盒購自安徽大千生物；白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA試劑盒購自美國貝克曼庫爾特有限公司；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒(批號：11684817910)購自美國羅氏公司；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司。

1.1.3儀器 Sysmex-chemix-180 型全自動生化分析儀購自日本 Furuno Electric公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TGL-16M低溫離心機購自濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學儀器廠；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司。

1.2方法

1.2.1分組及建立模型 將75只小鼠適應性喂養(yǎng)1周，采用隨機分組法分為：健康對照組(Control)、模型組(MPTP)、圣草次苷低劑量組(Eriocitrin 8 mg/kg)、圣草次苷中劑量組(Eriocitrin 16 mg/kg)、圣草次苷高劑量組(Eriocitrin 32 mg/kg)，每組各15只；將模型組、圣草次苷低劑量組、圣草次苷中劑量組、圣草次苷高劑量組小鼠制成帕金森小鼠模型，制作方法參考趙夢蝶等[6]研究具體操作如下：腹腔注射20 mg/(kg·d)的MPTP溶液，持續(xù)一周制成帕金森小鼠模型，完成造模后，腹腔注射啊撲嗎啡 0.5 mg/kg，10～15 min大鼠出現(xiàn)單側(cè)旋轉(zhuǎn)現(xiàn)象，持續(xù)記錄30 min，若旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均>7 r/min，即為造模成功。

1.2.2藥物干預 將水溶性圣草次苷溶解于生理鹽水中，按照劑量配置圣草次苷水溶液。圣草次苷低劑量組(80 mg/kg)、圣草次苷中劑量組(16 mg/kg)、圣草次苷高劑量組(32 mg/kg)使用圣草次苷灌胃處理，模型組和空白對照組使用等量的生理鹽水處理。

1.2.3檢測項目

1.2.3.1小鼠行為學實驗 小鼠行為學實驗采用：曠場實驗、懸掛實驗和游泳實驗，三個實驗均在同一天進行。曠場實驗：曠場裝置由黑色方形基座和黑色墻壁組成。將小鼠放置在房間的角落，適應1 min后，使用視頻計算機跟蹤系統(tǒng)記錄小鼠自發(fā)活動5 min 運動路程與停留時間。

小鼠完成曠場實驗后休息2 h開始懸掛實驗，將小鼠懸掛在水平尼龍線上，離開地面20 cm，記錄小鼠能用一只爪抓住尼龍繩的時間。

小鼠完成懸掛實驗后休息2 h開始游泳實驗：將小鼠放入水池中，水池大小為30×30×30 cm，水溫為28℃，記錄小鼠游泳力竭開始下沉時間。

1.2.3.2HE染色和TUNEL染色 完成小鼠行為實驗后使用斷頸法處死小鼠，去小鼠腦組織，使用二甲苯浸泡、不同梯度酒精脫水、蘇木精浸泡、鹽酸酒精分化、沖洗、伊紅染色、酒精浸泡、二甲苯浸泡，分別采用TUNEL 染色和HE染色，最后中性樹膠封片即可。在10×40的倍鏡觀察小鼠腦組織凋亡情況。

1.2.3.3Western blot 檢測蛋白表達水平 使用Western blot 檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白，取小鼠腦組織，使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗，二抗，孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.2.3.4ELISA檢測 取小鼠腦組織，剪碎并使用胰蛋白酶制成勻漿，嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒測操作，測定小鼠肝組織中IL-6、TNF-α、iNOS和IL-10含量水平。

2 結(jié)果

2.1小鼠行為學實驗檢測結(jié)果 由表1小鼠行為學實驗可以看出，相比健康對照組，模型組小鼠曠場移動路程、曠場中心區(qū)域活動時間、游泳時間和懸掛時間均顯著降低(P<0.05)；相比模型組，圣草次苷低劑量組曠場移動路程、曠場中心區(qū)域活動時間、游泳時間和懸掛時間均無顯著變化(P>0.05)，圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組曠場移動路程、曠場中心區(qū)域活動時間、游泳時間和懸掛時間顯著升高(P<0.05)。

2.2染色觀察小鼠神經(jīng)元凋亡情況 由圖1 HE染色和TUNEL染色可以看出，空白對照組小蘇神經(jīng)元細胞分布均勻，且基本無壞死；模型組小鼠組神經(jīng)細胞分布散亂，且數(shù)量缺失明顯增多，壞死細胞較多；圣草次苷低劑量組，細胞分布較為散亂，有較多的細胞缺失和壞死；圣草次苷中劑量組神經(jīng)細胞分布較為整齊，少量神經(jīng)細胞缺失和壞死。

2.3小鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達情況 由表2蛋白質(zhì)印跡實驗可以看出，相比空白對照組，模型組小鼠Bcl-2蛋白表達顯著降低，Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量組Caspase-3蛋白表達無顯著差異(P>0.05)；相比模型組，使用圣草次苷處理各組小鼠Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達水平顯降低(P<0.05)。

2.4試劑盒檢測小鼠黑質(zhì)中相關(guān)物質(zhì)含量水平 由表2可以看出，相比空白對照組，模型組小鼠SOD水平顯著降低，MDA、LDH、GSH水平顯著升高(P<0.05)；相比模型組，圣草次苷低劑量組MDA、SOD、LDH、GSH水平均無顯著變化(P>0.05)；相比模型組，圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組MDA、LDH、GSH水平顯著降低，SOD水平顯著升高(P<0.05)。

2.5ELISA檢測小鼠外周血相關(guān)物質(zhì)含量水平 由表3 ELISA 檢測結(jié)果可以看出，相比空白對照組，模型組小鼠TNF-α、IL-6、iNOS水平顯著升高(P<0.05)，IL-10無顯著變化(P>0.05)；相比模型組，圣草次苷低劑量組TNF-α、IL-6、iNOS、IL-10水平均無顯著變化(P>0.05)；相比模型組，圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組TNF-α、IL-6、iNOS水平顯著降低，IL-10水平顯著升高(P<0.05)。

GroupsnField travel(cm)Activity time(s)Swimming time(s)Hang time(s)Control153 324.56±132.366.13±0.39153.12±10.92123.65±12.32MPTP152 067.31±113.121)3.08±0.451)62.13±9.031)56.52±7.841)Eriocitrin(8 mg/kg)152 106.45±109.673.14±0.2464.06±8.2860.12±8.73Eriocitrin(16 mg/kg)152 698.12±138.542)4.52±0.522)96.54±11.332)84.26±11.172)Eriocitrin(32 mg/kg)152 916.87±126.492)5.77±0.472)123.25±13.022)103.97±14.932)

Note：1)P<0.05，compared with Control group;2)P<0.05，compared with MPTP group.

2.6蛋白質(zhì)印跡檢測相關(guān)信號通路蛋白表達情況 由圖2蛋白質(zhì)印跡實驗可以看出，相比空白對照組，模型組小鼠Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；相比模型組，使用圣草次苷處理各組小鼠腦組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。

圖1 染色觀察小鼠神經(jīng)元凋亡情況

GroupsnMDA(mmol/ml)SOD(U/ml)LDH(U/L)GSH(U/ml)Control152.15±0.317.03±0.81789.39±125.0442.05±4.58MPTP155.42±0.541)2.18±0.571)2134.61±284.591)94.27±8.211)Eriocitrin(8 mg/kg)155.28±0.462.54±0.262091.42±234.6291.34±6.73Eriocitrin(16 mg/kg)153.62±0.352)5.14±0.392)1432.39±135.782)65.06±8.192)Eriocitrin(32 mg/kg)152.74±0.522)7.53±0.422)923.48±107.132)53.18±7.522)

Note：1)P<0.05 means comparison with healthy control group;2)P<0.05 means comparison with model group.

GroupsnTNF-α (pg/ml)IL-6(pg/ml)iNOS (pg/ml)IL-10 (pg/ml)Control1545.38±6.5412.39±3.0954.64±8.828.17±1.67MPTP15234.24±25.841)86.27±11.251)201.42±23.481)9.73±1.88Eriocitrin(8 mg/kg)15219.48±19.4284.56±9.34196.43±26.6610.69±2.36Eriocitrin(16 mg/kg)15126.73±16.842)49.81±6.122)125.62±15.282)14.36±2.052)Eriocitrin(32 mg/kg)1579.48±11.922)26.15±5.172)84.32±8.932)22.21±3.532)

Note：1)P<0.05，compared with Control group;2)P<0.05，compared with MPTP group.

圖2 小鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白表達情況

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測相關(guān)信號通路蛋白表達情況

3 討論

神經(jīng)功能評分是衡量PD嚴重程度的重要指標之一，PD患者黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性壞死會使得行為受到一定的限制和滯后[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組曠場移動路程、曠場中心區(qū)域活動時間、游泳時間和懸掛時間顯著升高，但圣草次苷低劑量組則無顯著變化。說明使用圣草次苷可以有效改善小鼠神經(jīng)功能，但當劑量低于16 mg/(kg·d)時無顯著效果。

神經(jīng)細胞的凋亡是為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，且受到凋亡相關(guān)基因控制，但當神經(jīng)凋亡過多則會導致神經(jīng)功能受到影響[8]。caspase家族基因是控制凋亡的重要基因之一，當細胞凋亡途徑激活后，上游信號經(jīng)傳遞能夠激活下游caspase-9的活化，放大凋亡信號，激活caspase-3，而凋亡信號一旦傳遞到caspase-3蛋白活化，細胞凋亡進入不可逆階段[9,10]。除了caspase家族，Bcl-2家族也是控制細胞凋亡的重要基因之一，主要包括Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達量決定細胞是否凋亡[11-13]。Bax和Bcl-2表達呈相反趨勢，當Bcl-2表達下降時 Bax 表達上升，此時會促進細胞的凋亡；當Bcl-2 表達升高，而 Bax 表達降低時，則會抑制細胞的凋亡。本實驗中可以看出，相比模型組，使用圣草次苷處理各組小鼠Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達水平顯降低，同時可以從HE染色和TUNEL染色實驗看出，使用圣草次苷處理后小鼠腦神經(jīng)細胞凋亡顯著降低，說明圣草次苷可以降低相關(guān)凋亡蛋白的表達，促進抑制凋亡的蛋白表達，實現(xiàn)抑制腦神經(jīng)細胞的凋亡，保護神經(jīng)細胞的作用。

炎癥反應時影響PD的重要參數(shù)之一，其中TNF-α是一種多功能的調(diào)控炎癥因子，其可以通過直接或間接的形式加速脂質(zhì)對血管的穿透作用，促進脂紋和斑塊的形成[14]；iNOS的高表達，降低血管的收縮能力，會引起腦血管狹窄導致供血不足影響神經(jīng)細胞功能；IL-10是抑炎癥因子，升高其含量水平可以有效抑制炎癥反應，緩解炎癥帶來的損傷[15]。氧化應激也是加重PD癥狀的重要因素之一?？寡趸w系主要包括酶系和非酶系兩大類，酶系中，最主要的是SOD，其含量多少可以直接反應氧化應激的程度[16]。同時MAD含量增加，并且會使得患者機體的抗氧化能力減弱，導致腦細胞和線粒體膜受損，引起血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，同時也會使得腦組織游離脂肪酸水平明顯升高，誘發(fā)細胞功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)相比模型組，圣草次苷中劑量組和圣草次苷高劑量組TNF-α、IL-6、iNOS、MDA、LDH、GSH水平顯著降低，IL-10、SOD水平顯著升高，圣草次苷低劑量組均無顯著變化。說明使用圣草次苷可以有效降低PD小鼠氧化應激同時降低炎癥反應，但當劑量低于16 mg/(kg·d)時無顯著效果。鮑琛等[17]研究表明：降低氧化應激反應和炎癥反應可以有效治療PD，與本研究得出的結(jié)論一致。

Nrf2/HO-1抗氧化反應元件通路是一種可以發(fā)揮內(nèi)源性抗氧化作用來拮抗氧化應激損傷[18]。在PD 患者黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元中Nrf2 多數(shù)已經(jīng)核轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，表達Nrf2可以減輕6-OHDA 對多巴胺神經(jīng)元損傷保護神經(jīng)細胞，本研究發(fā)現(xiàn)，相比模型組，使用圣草次苷處理各組小鼠腦組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平顯著升高。說明圣草次苷可以激活Nrf2/HO-1通路，促進HO-1、NQO1蛋白表達和多巴胺競爭多巴胺轉(zhuǎn)運體進入紋狀體-黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，發(fā)生氧化應激反應增強細胞解毒進程和抗氧化能力。趙貝貝等[19]研究表明：激活Nrf2/HO-1可以增強小鼠的抗氧化能力治療PD，與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述，圣草次苷可以通過抑制氧化應激、炎癥反應，神經(jīng)細胞的凋亡并激活Nrf2/HO-1信號通路緩解MPTP誘導的慢性PD。但本次實驗所涉及的樣本量較少，在后續(xù)實驗中將進一步擴大樣本量進行分析。