杜艷平，區(qū)俊文，習(xí)文韜，金昭延，楊鵬程

廣州中醫(yī)藥大學(xué)祈福醫(yī)院營養(yǎng)科，廣東 廣州 510000

1,2-二甲基肼(DMH)是引起DNA中鳥嘌呤發(fā)生甲基化并誘發(fā)突變的烷化劑，是一種具有較好器官選擇性的常用化學(xué)誘癌劑，可被用于誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸癌。高脂飲食是常見的膳食模式，有Meta分析顯示，尚無充份證據(jù)證明該膳食模式與結(jié)腸癌發(fā)生有明顯的相關(guān)性[1]。但有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用DMH誘發(fā)大鼠結(jié)腸癌發(fā)生的過程中，高脂飲食可能介導(dǎo)炎癥進(jìn)展和細(xì)胞增殖，從而影響結(jié)腸癌的形成[2]。但高脂飲食與DMH在結(jié)腸癌發(fā)生早期，對腸道的作用及機(jī)制研究尚未見報(bào)道。

腸道正常的生理代謝需要完整的腸道結(jié)構(gòu)，并且腸道的氧化還原系統(tǒng)應(yīng)處于平衡狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腸道的氧化還原狀態(tài)被打破，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧基團(tuán)(ROS)，對腸道產(chǎn)生損害，破壞腸道黏膜細(xì)胞和上皮間緊密連接[3]。本研究應(yīng)用DMH作用于SD(Sprague-Dawley)大鼠，并同步給予高脂飲食，觀察在結(jié)腸癌發(fā)生早期，DMH和高脂飲食聯(lián)合對腸道的作用及腸道氧化還原狀態(tài)的改變，探討可能的作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 30只體質(zhì)量180~200 g的健康雄性SPF級SD大鼠，購自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。DMH購自Sigma公司，總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、總蛋白定量(考馬斯亮藍(lán)法)等檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購自廈門慧嘉生物。

1.2 動(dòng)物分組及處理 普通飼料喂養(yǎng)大鼠1周適應(yīng)環(huán)境后，按體質(zhì)量進(jìn)行編號后按照隨機(jī)分組的方法分為對照組、DMH組、DMH+高脂組，每組10只。實(shí)驗(yàn)室溫度保持在(20±4)℃，濕度60%~70%。代謝籠飼養(yǎng)大鼠，自由攝食飲水，對照組和DMH組給予普通飼料，DMH+高脂組給予高脂肪飼料，飼料均購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(普通飼料：能量3.85 kcal/g，其中脂肪供能比10%，碳水化合物70%，蛋白20%；高脂飼料：能量4.73 kcal/g，其中脂肪供能比45%，碳水化合物35%，蛋白20%)。對照組頸部皮下注射滅菌生理鹽水，DMH組和DMH+高脂組大鼠頸部皮下注射0.4%的DMH溶液(無菌生理鹽水配制，NaHCO3調(diào)節(jié)pH至6.5~7.0，劑量20 mg/kg)，隔天1次。

實(shí)驗(yàn)第15天，腹腔靜脈采血后處死所有大鼠；距回盲部5 cm分別取10 cm回腸和5 cm結(jié)腸，生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干后稱重，計(jì)算腸組織濕重(結(jié)果以mg/cm表示)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)期間，觀察大鼠皮毛、眼睛、營養(yǎng)狀況、活動(dòng)及糞便性狀等，分別于實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)第3、6、9、12、15天稱量大鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)第15天，大鼠處死后觀察腹腔及腸管變化；分別取1 cm回腸和結(jié)腸置于10%福爾馬林液中固定及脫水后、常規(guī)石蠟包埋切片、HE染色，40及100倍光學(xué)顯微鏡下觀察腸道的病理學(xué)特征。

1.4 指標(biāo)測定 取回腸和結(jié)腸組織，稱重后以1:9的比例加入生理鹽水，制備10%的結(jié)腸勻漿，參考試劑盒說明檢測T-AOC、MDA、SOD、MPO、NO等指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況比較 對照組大鼠行動(dòng)自如，眼睛明亮，毛發(fā)有光澤，大便成形。DMH組和DMH+高脂組大鼠活動(dòng)量少，眼睛無神，毛發(fā)光澤稍差，大便稀爛不成形；各組大鼠整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均無死亡。

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；從實(shí)驗(yàn)第6天開始，DMH組大鼠體質(zhì)量明顯低于對照組和DMH+高脂組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但正常組和DMH+高脂組之間的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠體質(zhì)量變化曲線

2.2 各組大鼠腸組織濕重比較 實(shí)驗(yàn)第15天，DMH組和DMH+高脂組大鼠回腸和結(jié)腸濕重明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但DMH組和DMH+高脂組大鼠間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腸組織濕重比較s，mg/cm)

表1 各組大鼠腸組織濕重比較s，mg/cm)

注：與對照組比較，aP<0.05。

對照組DMH組DMH+高脂組F值P值images/BZ_9_207_1608_1203_1672.png10 10 10 47.96±4.69 40.54±4.15a 41.60±5.06a 7.457 0.003 69.25±3.61 63.79±5.07a 62.47±4.96a 6.127 0.006

2.3 各組大鼠腸組織的病理變化 回腸：對照組回腸黏膜未見異常改變，但DMH組、DMH+高脂組的大鼠回腸黏膜絨毛壞死脫落，腸黏膜上皮細(xì)胞壞死(圖2)。結(jié)腸：對照組結(jié)腸黏膜未見異常改變，但DMH組、DMH+高脂組大鼠結(jié)腸均可見不同程度炎癥細(xì)胞浸潤及上皮壞死(圖3)。

圖2 各組大鼠回腸黏膜的病理變化

圖3各組大鼠結(jié)腸黏膜的病理變化

2.4 各組大鼠回腸及結(jié)腸的勻漿脂質(zhì)過氧化水平比較 給予DMH的兩個(gè)組大鼠回腸勻漿的T-AOC、MDA、MPO和NO明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中DMH+高脂組的T-AOC、MDA高于DMH組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予DMH的兩組大鼠結(jié)腸勻漿T-AOC、MDA、MPO和NO明顯高于對照組，而SOD明顯低于對照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中DMH+高脂組的SOD水平明顯低于DMH組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠不同指標(biāo)的含量的比較

表2 各組大鼠不同指標(biāo)的含量的比較

注：與對照比較，aP<0.05；與DMH組比較，bP<0.05。

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3 討論

物質(zhì)代謝過程中，在腸道有氧的情況下不可避免產(chǎn)生自由基。當(dāng)DMH作用于腸道時(shí)，自由基產(chǎn)生過多，不能及時(shí)清除，會(huì)導(dǎo)致自由基在腸道的聚集，當(dāng)達(dá)到一定水平后，可對腸道細(xì)胞進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，腸道細(xì)胞受損，影響吸收功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DMH組大鼠的體質(zhì)量增長緩慢，回腸和結(jié)腸濕重均低于對照組，提示DMH損傷腸道功能，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。但DMH+高脂組大鼠由于攝入脂肪和總能量較高，體質(zhì)量增長相對較快，從第6天開始，體質(zhì)量均高于DMH組大鼠。

研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用DMH誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸癌發(fā)生過程中，結(jié)腸癌的發(fā)生與腸道脂質(zhì)過氧化所致的腸道上皮損傷有關(guān)[4]。而我們既往的研究也發(fā)現(xiàn)，DMH導(dǎo)致大鼠結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞浸潤，氧化還原系統(tǒng)失衡，MDA、T-AOC水平升高[5]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，給予DMH的兩個(gè)組均可見大鼠回腸和結(jié)腸損傷，回腸和結(jié)腸中T-AOC、MDA、MPO和NO均高于對照組，而結(jié)腸中SOD低于對照組，提示腸道氧化還原系統(tǒng)的失衡參與結(jié)腸癌早期階段。T-AOC可測量大鼠腸道中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平，腸道的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成過多，可導(dǎo)致T-AOC水平下降，但本研究中，DMH卻導(dǎo)致大鼠腸道組織中T-AOC升高，可能是由于在腸道受損早期代償性增高，具體還有待進(jìn)一步研究。

膳食模式與結(jié)腸癌的關(guān)系仍缺乏明確證據(jù)，但有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可增加結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[6]。同時(shí)，還有研究發(fā)現(xiàn)，長期攝入高脂飲食可導(dǎo)致小鼠腸組織T-AOC和SOD明顯降低，而ROS和MDA明顯升高，影響腸道消化酶活性，促進(jìn)DMH誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸癌的生長[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)，與DMH組相比，DMH+高脂組大鼠的回腸MDA升高，提示高脂飲食加重了大鼠小腸所致的氧化應(yīng)激狀態(tài)，而小腸代償性升高T-AOC水平以減少對腸道的損傷。

氧自由基攻擊腸道及腸道黏膜，可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化發(fā)生，誘發(fā)腸道損傷，引起MDA水平升高。CZYRKO等[8]發(fā)現(xiàn)隨著腸道組織受損程度的加重，MDA濃度也隨之升高，推測MDA可反映腸道自由基產(chǎn)生和腸道損傷情況。本研究發(fā)現(xiàn)，給予DMH的兩個(gè)組大鼠回腸和結(jié)腸中MDA含量均升高，其中DMH+高脂組大鼠的回腸組織中MDA含量高于DMH組。提示DMH引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，從而導(dǎo)致腸道受損，而高脂飲食則加重這一過程。

腸道擁有對抗自由基的防御系統(tǒng)，包括酶類抗氧化劑，其中較為重要的是SOD，能夠加速超氧陰離子生成O2和H2O2，后者在最終可生成無毒性的H2O分子，SOD活性水平能夠反映ROS的清除能力。本研究結(jié)果顯示，給予DMH的兩個(gè)組的結(jié)腸組織中含量降低，而DMH+高脂組SOD的含量低于DMH組。這提示SOD在結(jié)腸組織中起著重要的抗脂質(zhì)過氧化的作用，腸道消耗過多SOD從而導(dǎo)致其含量下降，也進(jìn)一步證實(shí)了高脂飲食可加重腸道功能損傷。

含鐵溶酶體MPO在特定條件下，能夠催化H2O2和Cl-進(jìn)行反應(yīng)轉(zhuǎn)為次氯酸，強(qiáng)氧化性可導(dǎo)致腸道氧化應(yīng)激和組織損傷。而NO是典型的帶一未成對電子的自由基，腸組織內(nèi)NO濃度過高的時(shí)候，能夠產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。本研究顯示給予DMH的兩個(gè)組大鼠回腸和結(jié)腸組織中，MPO和NO均升高，但這兩個(gè)組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步說明DMH可導(dǎo)致腸道自由基產(chǎn)生增多，對腸道造成一定損傷。

綜上所述，DMH導(dǎo)致大鼠回腸和結(jié)腸損傷，引起腸道脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成增加，破壞腸道的抗氧化酶系統(tǒng)，高脂飲食可加重腸道氧化損傷，在誘發(fā)大鼠結(jié)腸癌的過程中起重要作用。