蔣 靜, 陳曉麗, 黃亞勵, 張奇龍,, 徐 紅, 楊小生

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物功效與利用國家重點實驗室;2. 公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室; 3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 貴陽 550025)

Scheme 1 Structures of host Q[8](A) and guest β-dichroine(B)

常山堿又名退熱堿(febrifugine)、β-常山堿(β-dichroine)和常山乙素(結(jié)構(gòu)見Scheme 1), 是從中藥常山(DichroafebrifugaLour.)中分離出來的一種喹唑酮類生物堿單體成分, 相對分子質(zhì)量為301, 分子式為C16H19O3N3, 是中藥常山發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ), 為中醫(yī)治瘧藥常山中的有效成分[1]. 常山為虎耳草科植物, 其根、 莖、 葉均有藥用價值, 根可治瘧疾, 葉和果可消氣, 果可用作調(diào)料及藥膳[2]. 常山中主要含有α,β和γ(甲、 乙和丙)3種常山堿, 三者互為異構(gòu)體, 在酸性、 堿性及加熱條件下不穩(wěn)定, 易發(fā)生異構(gòu)化改變[3,4]. 常山堿對間日瘧或惡性瘧疾有療效, 常山總生物堿的抗瘧效價約為奎寧(臨床抗瘧藥)的26倍,α-,β-和γ-常山堿對瘧疾的療效分別為奎寧的1, 100和150倍. 研究發(fā)現(xiàn), 常山堿及其衍生物具有良好的抗腫瘤、 增強(qiáng)免疫、 促進(jìn)傷口愈合及治療糖尿病等作用[5～9].

雖然, 常山在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景, 但其主要活性成分常山堿存在使人惡心及嘔吐等副作用[10], 因其毒副作用較大, 中藥常山在《中華人民共和國藥典》(2005年版一部)中被列為有毒藥材[11].臨床上常用常山復(fù)方口服治療瘧疾(單用胃腸反應(yīng)大), 可減低副作用反應(yīng), 雖生效快但停藥后易復(fù)發(fā), 并且會增加復(fù)方中其它藥物的攝入, 藥物配方安全性有待考量. 目前, 對于常山堿引起的胃腸道毒性機(jī)制的相關(guān)實驗研究較少, 限制了常山藥物的發(fā)展. 因此, 尋找能夠減輕常山堿惡心、 嘔吐等胃腸反應(yīng)副作用的方法對于常山堿的進(jìn)一步臨床應(yīng)用具有重要意義.

瓜環(huán)(Q[n]s,n=5～8, 10, 14)是由苷脲單元通過亞甲基橋聯(lián)起來的高度對稱的桶狀大環(huán)主體分子, 具有兩端開口的空腔, 兩端口大小相同, 端口直徑小于空腔直徑, 具有特殊的內(nèi)親水、 外疏水分子結(jié)構(gòu)[12～14]. 多種無機(jī)或有機(jī)分子可與瓜環(huán)端口及空腔通過籠體作用、 氫鍵、 范德華力及離子偶極等非鍵弱相互作用力形成穩(wěn)定的主-客體包結(jié)配合物(Ka=104～1015L/mol), 與環(huán)糊精和杯芳烴相比, 瓜環(huán)具有更強(qiáng)的絡(luò)合作用和更高的空間定位效應(yīng), 能形成較穩(wěn)定的包合物, 具有較好的分子識別功能[15]. 瓜環(huán)作為新一代的人工合成主體化合物, 在各種細(xì)胞和動物實驗中均表現(xiàn)出極低的毒性, 是一種安全的藥物載體[16～19], 并且能與多種藥物分子形成穩(wěn)定的主客體包合物, 其包結(jié)作用會對客體分子的一系列性質(zhì)(如溶解性、 穩(wěn)定性、 生物活性、 熒光光譜及電化學(xué)性質(zhì)等)產(chǎn)生影響, 使客體分子物理化學(xué)性質(zhì)均可能發(fā)生改變, 所以瓜環(huán)在藥物化學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[20～22]. 本文利用紫外吸收光譜、 核磁共振氫譜及紅外光譜等方法考察了八元瓜環(huán)(Q[8])與常山堿(Feb)的相互作用, 并研究了形成包合物后Q[8]對Feb理化性質(zhì)的影響, 為常山堿的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了研究思路和借鑒.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

八元瓜環(huán)(Q[8]), 純度97%, 貴州省大環(huán)化學(xué)及超分子化學(xué)重點實驗室提供; 常山堿(Feb), 純度≥98%, 四川省維克奇生物科技有限公司; 實驗用水均為二次蒸餾水; 溴化鉀(KBr)、 磷酸二氫鉀(KH2PO4)、 氫氧化鈉(NaOH)和鹽酸(HCl)等均為分析純, 重慶川東化工集團(tuán).

UV-2600型紫外-可見分光光度(UV-Vis)計, 日本島津公司; Inova-400 MHz型核磁共振波譜(NMR)儀, 美國Varian公司; VGT-2227QTD型超聲儀, 深圳市固特宏業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司; CP214型電子天平, 上海奧豪斯儀器有限公司; VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀, 德國Bruker公司; RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器, 上海亞榮生化儀器廠; pH S-25型酸度計, 成都世紀(jì)方舟科技有限公司; MD3型生物透析袋, 北京Solarbio科技有限公司; 1.0 mL/5.0 mL移液槍, 德國Eppendorf公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 不同pH條件下Q[8]與Feb相互作用的紫外吸收光譜測定 先配制濃度為100 μmol/L的Feb水溶液, 分別移取2.0 mL Feb水溶液置于7個10.0 mL標(biāo)定過的容量瓶中, 分別加入pH=0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0和6.0的稀HCl溶液各1.0 mL, 用蒸餾水定容至10.0 mL, 即調(diào)節(jié)pH值至1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0和7.0, 配好后立即分別測定其紫外吸收光譜. 用蒸餾水分別配制濃度為100 μmol/L的Q[8]溶液和Feb溶液, 分別量取2.0 mL Q[8]溶液和Feb溶液置于10.0 mL標(biāo)定過的容量瓶中, 分別加入pH=0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0和6.0的HCl溶液各1.0 mL, 用蒸餾水定容至10.0 mL, 即調(diào)節(jié)pH值至1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0和7.0, 配好后立即分別測定其紫外吸收光譜. 由上述實驗結(jié)果可知, Q[8]與Feb在pH=1.2時的相互作用力較強(qiáng), 由于pH=1.2是后續(xù)考察藥物釋放的生理模擬實驗條件, 因此選擇pH=1.2作為實驗pH值條件. 因此, 分別用蒸餾水配制濃度為100 μmol/L的Q[8]溶液(pH=1.2)和Feb溶液(pH=1.2)作為儲備液.

1.2.2 pH=1.2時Q[8]與Feb相互作用的紫外吸收光譜測定 采用摩爾比法和等摩爾連續(xù)變化法(Job法)法分別測定溶液的紫外吸收光譜. 摩爾比法, 即固定客體的濃度, 改變瓜環(huán)的濃度配制不同摩爾比的主客體溶液. 向標(biāo)定過的10.0 mL容量瓶中分別加入2.0 mL 100 μmol/L Feb溶液, 配制Q[8]與Feb摩爾比分別為0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2, 2.5, 3.0和3.5的混合溶液, 用pH=1.2的鹽酸溶液定容. Job法, 即固定客體的濃度或保持客體和主體的總濃度(100 μmol/L)不變, 改變Q[8]的濃度配制Q[8]/Feb摩爾比分別為0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9和1.0的溶液. 溶液配好后立即于室溫下測定其紫外吸收光譜.

1.2.3 pH=1.2時Q[8]與Feb相互作用的熒光光譜測定 采用摩爾比法和Job法配制溶液, 立即于室溫測定其熒光光譜, 激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm, 激發(fā)波長230 nm, 發(fā)射波長340 nm.

1.2.4 Q[8]與Feb相互作用的1H NMR測定 在V(DCl)∶V(D2O)=1∶99條件下, 以D2O溶液作為溶劑溶解Q[8]和Feb, 固定客體的量, 向體系中逐漸加入Q[8], 于25 ℃測定體系的1H NMR.

1.2.5 Q[8]/Feb固體包合物的制備 按照n(Q[8])∶n(Feb)=1∶1稱取Q[8]和Feb, 加入100.0 mL pH=1.2的鹽酸溶液, 室溫下超聲3 h, 反應(yīng)結(jié)束后過濾除去不溶性沉淀, 得到無色澄清透明濾液, 將濾液于60 ℃下旋轉(zhuǎn)濃縮后烘干, 即得包合物固體.

1.2.6 紅外光譜的測定 分別稱取一定量的Feb, Q[8], Q[8]/Feb(摩爾比1∶1)物理混合物和Q[8]/Feb包合物, 加入KBr并壓片, 測定其紅外光譜, 掃描范圍為4000～500 cm-1.

1.2.7 不同pH值下Q[8]/Feb包合物中Feb的釋放 配制濃度為100 μmol/L的Q[8]水溶液(pH=1.2)和Feb水溶液(pH=1.2)作為儲備液. 分別量取上述溶液各15.0 mL混合于50 mL燒杯中, 放置10 min形成穩(wěn)定的Q[8]/Feb包合物溶液后, 用12 mol/L的NaOH溶液依次調(diào)節(jié)pH值至2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0和6.8, 于室溫下立即測定溶液的紫外吸收光譜.

1.2.8 Q[8]/Feb固體包合物在人工胃腸液中的緩釋測定 參照中國藥典2015年版二部[23], 采用恒溫振蕩法測定Q[8]/Feb固體包合物在人工胃腸液中的體外釋放行為. 分別稱取包合物5.0 mg置于透析袋內(nèi), 扎緊袋口后置于盛有80.0 mL人工胃液(pH=1.2的鹽酸水溶液)或人工腸液(pH=6.8的磷酸鹽緩沖液)的圓底燒瓶中, 于(37±0.5) ℃恒溫振蕩器內(nèi)釋放, 轉(zhuǎn)速100 r/min. 分別隔一定時間取樣液3.0 mL, 同時向釋放體系中補(bǔ)充3.0 mL新鮮人工腸液或人工胃液, 以維持釋放體系的體積不變. 釋放液樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾, 于228 nm波長處測定其紫外吸收值, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算藥物的含量. 藥物累積釋放率R(%)根據(jù)下式計算:

R=[80.0cFeb(n)+3.0∑cFeb(n-1)]/m0×100%

式中:cFeb(n)(mg/mL)為第n次提取時藥物在溶液中的濃度;cFeb(n-1)(mg/mL)為第n-1次提取時藥物在溶液中的濃度;m0(mg)為藥物Feb在包合物中的質(zhì)量; 80.0(mL)為緩沖溶液的體積; 3.0(mL)為每次取出的溶液體積.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH條件下Q[8]與Feb相互作用的紫外吸收光譜分析

據(jù)文獻(xiàn)[4]報道, Feb在中性和酸性條件下可穩(wěn)定存在, 而在堿性條件下則發(fā)生降解, 因此考察了pH=1.0～7.0對Feb的存在形態(tài)的影響. 由圖1可見, 隨著pH值的增大, Feb的吸光度值逐漸增大, 當(dāng)pH值增大到3.0時, 吸光度值基本不再改變, 表明pH值對Feb的溶解度有影響, 即在較強(qiáng)酸性(pH<3.0) 條件下, Feb溶解度略低, pH=3.0～7.0時, 溶解度較高.

Fig.1 UV spectra of Feb(A) and the absorbance intensity plot at 228 nm(B) of Feb at different pH values c(Feb)=20 μmol/L.

考察了不同pH條件下Feb與Q[8]相互作用的紫外吸收光譜變化. 由圖2(A)可見, 加入Q[8]溶液后, 隨著pH值的改變, 溶液的吸光度值發(fā)生變化, 通過與未加Q[8]時的譜圖[圖2(B)]對比發(fā)現(xiàn), 隨著pH值的下降(pH值從4.0至1.0), 紫外吸收光譜強(qiáng)度ΔA(AFeb-AFeb/Q[8])逐漸增大[圖2(C)], 說明Feb與Q[8]發(fā)生了相互作用, 改變了溶液的吸光度. 在pH=1.0時, ΔA值最大, 說明此條件下Feb與Q[8]的相互作用最強(qiáng); 而在pH=4.0～7.0時, ΔA值變化不大, 表明Feb與Q[8]相互作用能力較弱. 由于在pH=1.2時Feb與Q[8]相互作用能力較強(qiáng), 且pH=1.2是人工胃液的生理環(huán)境, 也是后續(xù)考察藥物釋放的模擬生理實驗條件. 因此, 后續(xù)考察Feb與Q[8]相互作用的紫外吸收光譜、 熒光光譜變化以及作用比例時均采用pH=1.2作為實驗條件.

Fig.2 UV spectra of Feb with Q[8] at different pH values(A), trend chart of simple Feb solution and after addition the Q[8](B) and ΔA value(C) of AFeb and AFeb/Q[8] λ=228 nm; c(Feb)=20 μmol/L.

2.2 Q[8]與Feb相互作用的紫外吸收光譜分析

圖3為pH=1.2時Feb與Q[8]相互作用的紫外吸收譜圖. 在pH=1.2時, Feb在228 nm處有最大吸收峰, Q[8]在大于210 nm波長范圍內(nèi)均無吸收. 隨著主體Q[8]濃度的增加, 客體Feb的吸收強(qiáng)度逐漸下降, 說明Q[8]與Feb發(fā)生了相互作用. 當(dāng)二者的摩爾比為1∶1時,A～n(Q[8])/n(Feb)曲線出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點, 繼續(xù)增大瓜環(huán)的量吸收強(qiáng)度無明顯變化, 說明二者相互作用形成了摩爾比為1∶1的包合物. 同時, Job法在n(Q[8])/[n(Q[8])+n(Feb)]≈0.5時, ΔA出現(xiàn)最大值, 即Q[8]/Feb體系的作用比為1∶1, 這與摩爾比法所得結(jié)論一致. 通過非線性擬合得到Q[8]與Feb的結(jié)合常數(shù)為4.20×104L/mol.

Fig.3 UV spectra(A) and Job’s plot(B) of Feb with Q[8](A) c(Feb)=20 μmol/L; n(Q[8])/n(Feb), a—k: 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5. Inset of (A): absorption intensity plot at 228 nm of Feb upon addition of increasing concentrations of Q[8].

Fig.4 Fluorescence emission spectra(A), and Job’s plot(B) of Feb with Q[8](A) c(Feb)=20 μmol/L; n(Q[8])/n(Feb), a—l: 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0. Inset of (A): the fluorescence intensity plot at 340 nm of Feb upon addition of increasing concentrations of Q[8].

2.3 Q[8]與Feb相互作用的熒光光譜分析

圖4為pH=1.2時, 瓜環(huán)Q[8]與客體Feb相互作用的熒光發(fā)射光譜圖, 在225 nm波長光激發(fā)下, Feb的最大熒光發(fā)射波長為340 nm. 隨著瓜環(huán)量的增加, Feb在340 nm波長處的熒光強(qiáng)度逐漸降低, 說明Q[8]與Feb發(fā)生了主客體相互作用. 摩爾比法和Job法表明, Q[8]與Feb相互作用的摩爾比為1∶1. 與紫外吸收光譜測試結(jié)果一致.

2.4 Q[8]與Feb相互作用的核磁共振氫譜分析

Fig.5 1H NMR spectra of interaction between Q[8] and Feb(pH=1.2) a. Q[8]; b. n(Q[8])/n(Feb)=1∶1; c. Feb.

圖5給出了Q[8]與Feb相互作用的1H NMR譜圖. 由圖5可知, 相對于游離客體Feb, 當(dāng)向體系中加入Q[8]后, 客體Feb的質(zhì)子發(fā)生了不同程度的化學(xué)位移, H2, H7, H8和H6分別向高場移動了δ0.05, 0.03, 0.06和0.03, Hγ則向低場移動了δ0.26, 而其它質(zhì)子未發(fā)生明顯位移, 說明Feb分子的芳香環(huán)進(jìn)入了Q[8]空腔, 并因此受到瓜環(huán)的屏蔽效應(yīng)影響, 從而使質(zhì)子峰向高場移動. Hγ向低場移動, 推斷其可能正好處于Q[8]的端口, 因為瓜環(huán)在端口外部形成的核磁去屏蔽區(qū), 會使處于該區(qū)域的質(zhì)子的化學(xué)位移受到去屏蔽效應(yīng)而向低場移動. 因此, 由核磁共振氫譜表征結(jié)果推測Q[8]與Feb的相互作用模式如Scheme 2所示.

Scheme 2 Interaction mode of Feb with Q[8]

2.5 紅外光譜分析

Fig.6 IR spectra of Q[8] with Feba. Feb; b. Q[8]; c. Feb/Q[8] physical mixture; d. Feb/Q[8] Inclusion complex.

Fig.7 Release of Feb at different pH valuespH, a—f: 1.2, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.8. Inset: absorbance intensity plot at 228 nm of Q[8]/Feb.

2.6 不同pH值下Q[8]/Feb包合物中Feb的釋放

圖7為Q[8]/Feb包合物溶液隨pH值變化(1.2～6.8)的紫外吸收光譜圖. 可見, 隨著pH逐漸增大, 溶液吸光度值逐漸增大, 當(dāng)pH>3.0時, 吸光度值基本趨于平穩(wěn), 不再發(fā)生改變. 此結(jié)果表明, 當(dāng)溶液pH值從1.2增大至3.0時, Q[8]/FebQ包合物能夠逐漸釋放出游離Feb分子, 當(dāng)pH>3.0時, 達(dá)到了完全釋放.

Fig.8 Release of Q[8]/Feb inclusion complex at pH=1.2(a) and 6.8(b)

根據(jù)上述實驗結(jié)果, 可以推斷在pH=1.2時質(zhì)子化的Feb分子可與Q[8]形成穩(wěn)定包合物. 當(dāng)pH>3.0時, Q[8]/Feb包合物可釋放出游離Feb分子, 即在人工胃液(pH=1.2)中質(zhì)子化的Feb分子可與Q[8]以穩(wěn)定包合物形式存在, 而在人工腸液(pH=6.8)中Feb分子則從八元瓜環(huán)空腔釋放出來.

2.7 Q[8]/Feb固體包合物在人工胃腸液中的緩釋

由圖8可見, Q[8]/Feb固體包合物釋放受介質(zhì)pH值的影響較大. 在10 min時, Q[8]/Feb固體包合物在人工胃液(pH=1.2)和人工腸液(pH=6.8)中的累積釋放度分別為65.35%和72.79%; 在50 min時, 累積釋放度分別為89.06%和96.20%. 可見, Q[8]/Feb固體包合物在人工腸液(pH=6.8)中的釋放度大于人工胃液(pH=1.2).

3 結(jié) 論

在pH=1.2的鹽酸介質(zhì)中, Feb可與Q[8]發(fā)生相互作用, 形成摩爾比為1∶1的主-客體包合物, 主-客體結(jié)合常數(shù)為4.20×104L/mol. Feb在pH=1.2(人工胃液)時可與Q[8]形成穩(wěn)定包合物, 在pH=6.8(人工腸液)時Q[8]/Feb包合物可釋放出單純的游離Feb, 即在胃液里穩(wěn)定存在, 腸液里釋放. Q[8]作為Feb的一種潛在藥物載體, 其減輕常山堿嘔吐副反應(yīng)的作用還有待進(jìn)一步的研究.