彭與煜, 王 煜, 于鑫垚, 曾巨瀾, 肖忠良, 曹 忠

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院, 電力與交通材料保護(hù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長沙 410114)

L-半胱氨酸(L-Cys)作為一種脂肪族含巰基的極性α-氨基酸, 是人體的條件必需氨基酸和生糖氨基酸, 在體內(nèi)蛋白質(zhì)折疊、 代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)、 解毒以及對(duì)重金屬的親和力等生理過程中起著至關(guān)重要的作用[1～3].L-Cys還是生物體多種疾病如肝損傷、 心臟病、 皮膚病、 敗血癥、 艾滋病、 帕金森癥和阿爾茨海默氏病以及癌癥等治療的標(biāo)志物和重要配方藥品[4～6], 但過多服用L-Cys也會(huì)造成人體血糖的降低和中樞神經(jīng)損傷[2,7]. 因此, 快速靈敏檢測(cè)L-Cys方法的發(fā)展變得至關(guān)重要, 并引起了廣泛關(guān)注.

目前, 檢測(cè)L-Cys的常用方法有比色法[8,9]、 分光光度法[10]、 拉曼光譜法[11]、 高效液相色譜法[12]、 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14]、 熒光分析法[15]及光電化學(xué)分析法[16]等, 這些方法多數(shù)需要昂貴的精密儀器或復(fù)雜的樣品制備流程, 不方便實(shí)地實(shí)時(shí)使用. 目前, 現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境實(shí)時(shí)檢測(cè)、 移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室和便攜式檢測(cè)儀器等方法具有良好的發(fā)展前景[17～21], 其中簡單、 快速的電化學(xué)傳感分析方法被逐漸應(yīng)用于檢測(cè)氨基酸等含氮分子[21～27]. Selvarajan等[28]將NH2—官能化的BaTiO3納米顆粒懸浮在三維基質(zhì)的瓊脂糖膜中, 通過電流-電壓技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)自供能的L-Cys傳感器, 并通過非侵入式方法對(duì)尿液中的L-Cys進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè), 該方法具有良好的選擇性和線性范圍, 檢測(cè)下限達(dá)到10 μmol/L. Amini等[29]制備了雙水楊醛鄰苯二胺鈷配合物修飾的碳糊電極, 其對(duì)半胱氨酸有靈敏電位響應(yīng), 線性范圍為2～10 μmol/L, 檢測(cè)下限為1 μmol/L. Bai等[30]采用電化學(xué)共沉積法制備了β-二氧化錳納米線-殼聚糖修飾玻碳電極, 該電極對(duì)L-Cys顯示出優(yōu)異的電催化氧化電流響應(yīng), 測(cè)定范圍達(dá)到0.5～630 μmol/L, 檢測(cè)下限為70 nmol/L.

盡管電流型電化學(xué)傳感器的響應(yīng)性能在不斷提高, 但與電位型電化學(xué)傳感器相比, 其仍存在操作流程較繁瑣、 儀器電路設(shè)計(jì)較復(fù)雜及不方便攜帶等問題; 而電位型電化學(xué)傳感器如選擇性膜電極具有制作簡單、 便于攜帶、 易于微型化和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)[21,31～38], 且適用于在線和現(xiàn)場(chǎng)分析, 在測(cè)定無機(jī)離子和含氮有機(jī)分子方面有良好的應(yīng)用前景. Shahrokhian[36]制備了一種基于鉛酞菁作為離子載體的L-Cys選擇性電極, 將鉛酞花青結(jié)合到增塑的聚氯乙烯膜中, 電極具有良好的長期穩(wěn)定性和抗干擾能力, 其檢測(cè)L-Cys的線性范圍為1×10-6～5×10-2mol/L, 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-57.8 mV/pc, 檢測(cè)下限為1.0×10-6mol/L. 目前, 用于高選擇性、 高靈敏性測(cè)定生物體液中L-Cys的電位型傳感分析方法仍然極具挑戰(zhàn)性.

β-環(huán)糊精(β-CD)是直鏈淀粉在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的由7個(gè)吡喃葡萄糖單元組成的環(huán)狀低聚糖[39].β-環(huán)糊精具有外緣親水而內(nèi)腔疏水的特殊筒狀結(jié)構(gòu), 可以與多種金屬離子、 生物藥物分子及有機(jī)分子等結(jié)合形成主客體包合物, 從而備受關(guān)注[40～45], 特別是可以將其應(yīng)用于氨基酸含氮小分子的識(shí)別檢測(cè)[22,46]. 但迄今鮮見基于巰基功能化β-環(huán)糊精修飾電極用于L-Cys檢測(cè)的電位型傳感器的研究報(bào)道.

基于此, 本文通過分子自組裝方法將(6-巰基-6-去氧)-β-環(huán)糊精修飾在金電極表面, 構(gòu)建了一種成本低、 響應(yīng)快、 靈敏度高且易于微型化的電位型電化學(xué)傳感器. 該電極對(duì)L-Cys有良好的電位響應(yīng)性能, 可用于豬血清和尿液中L-Cys的快速靈敏檢測(cè), 檢測(cè)下限達(dá)到6.0×10-8mol/L, 在生命科學(xué)、 生物醫(yī)學(xué)和畜禽健康養(yǎng)殖等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Fig.1 Structures of HS-β-CD(A) and L-Cys(B)

單(6-巰基-6-去氧)-β-環(huán)糊精(HS-β-CD, C42H70O34S,Mw=1151.05), 結(jié)構(gòu)如圖1(A)所示, 購于山東濱州智源生物科技有限公司;L-Cys[結(jié)構(gòu)見圖1(B)]、L-纈氨酸(L-Val)、L-色氨酸(L-Trp)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-蘇氨酸(L-Thr)、L-丙氨酸(L-Ala)、L-異亮氨酸(L-Ile)、L-甘氨酸(L-Gly)、L-精氨酸(L-Arg)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-胱氨酸(L-Cyn)、L-甲硫氨酸(L-Met)、L-組氨酸(L-His)、L-賴氨酸(L-Lys)、 尿酸(UA)、 葡萄糖(GLC)以及NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海); 鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀、 乙醇、 鹽酸、 氫氧化鈉、 氯化鈣、 氯化鉀及氯化鈉購于湖南試劑廠(株洲). 所用試劑均為分析純, 實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電導(dǎo)率≥18.3 MΩ·cm).

奧利龍868型pH/mV計(jì)(美國Thermo Orion公司); PHSJ-3F型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠); 217型雙鹽橋飽和甘汞電極(上?？祵庪姽饧夹g(shù)有限公司); CHI-760B型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司); KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); JCP-ZZ-200B型磁控濺射/蒸鍍多功能一體化鍍膜機(jī)(北京泰科諾科技有限公司); EBV-6DA型熱蒸鍍儀(日本ULVAC公司); MIRA3型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM, 捷克TESCAN公司); K-Alpha 1063型X射線光電子能譜儀(XPS, 英國Thermo Fisher公司); Agilent 1260型高效液相色譜儀(HPLC, 美國Agilent公司).

1.2 HS-β-CD/GE電極的制備

將雙氧水和濃硫酸按體積比1∶3混合配制Piranha溶液. 將金電極在超純水中超聲清洗5 min, 再依次用1.0, 0.3和0.05 μm的Al2O3粉打磨拋光, 分別在乙醇和超純水中超聲清洗5 min, 自然晾干后置于Piranha溶液中浸泡20 min, 再依次用超純水、 乙醇和超純水超聲清洗, 自然晾干; 將該裸金電極浸泡于5×10-3mol/L HS-β-CD的氫氧化鈉溶液中24 h; 將HS-β-CD自組裝膜修飾的金電極取出, 分別用乙醇和超純水洗凈, 干燥后備用.

1.3 HS-β-CD/GE電極的性能測(cè)試

以5.0 mmol/L的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和0.5 mol/L Na2SO4溶液為氧化還原電解質(zhì)溶液, 采用交流阻抗和循環(huán)伏安(CV)法檢測(cè)自組裝膜修飾電極的性能. 以雙鹽橋飽和甘汞電極為參比電極, HS-β-CD修飾的金電極為工作電極, 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣品溶液中的L-Cys. 使用的PBS緩沖溶液(0.010 mol/L)的pH=3.0～9.0, 其配制方法是將一定比例的NaH2PO4·2H2O, Na2HPO4·12H2O和NaCl溶于超純水, 通過滴加鹽酸校正pH值. 新鮮配制的L-Cys標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為1.0×10-2mol/L, 用緩沖液逐級(jí)稀釋后備用.

1.4 樣品前處理及L-Cys的測(cè)定

豬血清和豬尿液樣品來源于6頭活體三元雜小豬(體重7～15 kg), 由中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所畜禽健康養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室提供. 分別將不同來源的6個(gè)豬血清和6個(gè)豬尿液樣品于8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心處理10 min, 取上層清液用pH=6.0的PBS緩沖液稀釋10倍, 采用HS-β-CD/GE電極測(cè)定L-Cys的含量, 并與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較, 同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 HS-β-CD/GE電極的SEM表征

采用SEM對(duì)裸GE電極、 HS-β-CD/GE電極及檢測(cè)L-Cys后的電極(L-Cys/HS-β-CD/GE)的表面形貌進(jìn)行了測(cè)試, 結(jié)果如圖2所示. 可見, 裸金電極表面的顆粒較整齊光滑[圖2(A)], HS-β-CD/GE電極表面的顆粒包裹有絮狀薄層物質(zhì)[圖2(B)], 說明HS-β-CD通過Au—S鍵自組裝在金電極表面, 而檢測(cè)L-Cys后電極表面的粗糙程度加大, 吸附物增多[圖2(C)], 表明L-Cys通過分子間作用吸附結(jié)合在HS-β-CD/GE膜表面.

Fig.2 SEM images of electrode surfaces for bare GE(A), HS-β-CD/GE(B) and L-Cys/HS-β-CD/GE(C) electrodes

2.2 HS-β-CD/GE電極的響應(yīng)原理及電化學(xué)性能

HS-β-CD是一種環(huán)狀巰基化合物, 一端含有巰基, 另一端是口腔狀的環(huán)形結(jié)構(gòu), 口腔環(huán)內(nèi)部疏水, 外部親水. 其一端的巰基可與Au通過Au—S鍵組裝在金電極表面, 另一端的口腔環(huán)上親水的羥基(OH—)可通過分子間作用力與L-Cys的巰基(SH—)和氨基(NH2—)形成氫鍵, 使L-Cys部分進(jìn)入環(huán)糊精空腔, 產(chǎn)生包合作用[39,47], 從而導(dǎo)致HS-β-CD/GE電極表面膜電位發(fā)生變化, 實(shí)現(xiàn)對(duì)L-Cys的超分子識(shí)別, 其響應(yīng)識(shí)別過程示意圖如圖3所示.

Fig.3 Schematic illustration of the response process of HS-β-CD/GE for L-Cys

為了探討自組裝金電極膜表面與L-Cys的相互作用關(guān)系, 采用循環(huán)伏安和交流阻抗法考察了上述不同電極在5.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6和 0.5 mol/L Na2SO4介質(zhì)溶液中的電化學(xué)行為, 結(jié)果如圖4所示. 圖4譜線a為裸金電極, 電流值較大, 且對(duì)應(yīng)的阻抗值很小, 說明裸金電極具有強(qiáng)傳遞電子能力. 譜線b為HS-β-CD修飾金電極, 由圖4(A)可見, 修飾后電極的電流值變小, 相應(yīng)的交流阻抗譜圖[圖4(B)]中高頻部分出現(xiàn)半圓, 阻抗值明顯增大, 說明HS-β-CD通過一端的巰基在金表面上形成了不導(dǎo)電的單分子自組裝膜層, 阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的電子傳遞. 修飾L-Cys(1.0×10-4mol/L)后, 電極的電流值增大[圖4(A)譜線c], 阻抗值相應(yīng)地減小[圖4(B)譜線c], 這是由于HS-β-CD通過另一端的環(huán)糊精空腔和L-Cys發(fā)生的強(qiáng)超分子結(jié)合作用而吸附了帶負(fù)電荷的L-Cys,L-Cys參與了電極表面的電子轉(zhuǎn)移過程, 增強(qiáng)了電子傳導(dǎo)性, 所以界面阻抗減小, 其阻抗的變化趨勢(shì)能從相應(yīng)的循環(huán)伏安譜圖中得到印證[如圖4(A)所示], 表明該方法用于L-Cys的識(shí)別檢測(cè)具有可行性.

Fig.4 Cyclic voltammetry(A) and impedance(B) curves of bare GE(a), HS-β-CD/GE(b), and L-Cys/HS-β-CD/GE(c) electrodes in the media solution of containing 5.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 and 0.5 mol/L Na2SO4

2.3 HS-β-CD/GE電極的XPS表征

Fig.5 XPS spectra of the surfaces for bare GE(a), HS-β-CD/GE (b) and L-Cys/HS-β-CD/GE(c) electrodes

為了進(jìn)一步研究HS-β-CD 修飾金電極與L-Cys 的作用機(jī)理, 采用X射線光電子能譜對(duì)裸GE, HS-β-CD/GE及L-Cys/HS-β-CD/GE電極表面進(jìn)行了測(cè)試. 由XPS能譜圖(圖5)分析其元素組成可以發(fā)現(xiàn)修飾電極與目標(biāo)物之間的相互作用關(guān)系[35,48]. 由圖5可知, 與裸金電極(譜線a)相比, 自組裝HS-β-CD后電極(譜線b)的Au4f, Au4d和Au4p峰的強(qiáng)度明顯下降, 其中Au4f的結(jié)合能從84.20 eV降低為83.58 eV, 下降了0.62 eV, 且C1s和O1s峰的強(qiáng)度明顯增大, 這是由于組裝HS-β-CD后電極表面形成了不導(dǎo)電的薄膜, HS-β-CD導(dǎo)致表面C和O的含量增加. 檢測(cè)L-Cys后,L-Cys/HS-β-CD/GE電極(譜線c)與HS-β-CD/GE電極(譜線b)相比, 表面N1s峰的強(qiáng)度有所增大, 這是由于加入L-Cys后, 帶負(fù)電的L-Cys以分子間作用力結(jié)合在HS-β-CD膜上或經(jīng)包合進(jìn)入環(huán)糊精空腔而導(dǎo)致表面N元素含量的增加; 而Au4f, Au4d和Au4p峰的強(qiáng)度明顯增大, 說明電極表面導(dǎo)電性相對(duì)于HS-β-CD/GE(譜線b)有所增強(qiáng), 這與上述電化學(xué)循環(huán)伏安和交流阻抗表征結(jié)果一致, 證明了HS-β-CD/GE對(duì)L-Cys的超分子識(shí)別作用.

2.4 HS-β-CD/GE電極的最佳修飾時(shí)間

研究了HS-β-CD/GE在pH=6.0條件下, 修飾時(shí)間分別為4, 8, 12, 24, 36和48 h時(shí), 電極電位隨L-Cys濃度(1.0×10-7～1.0×10-4mol/L)的變化關(guān)系[圖6(A)], 并依次求出其線性響應(yīng)段的斜率, 作出斜率與修飾時(shí)間的關(guān)系圖[圖6(B)]. 由圖6(A)可見, 該電極在修飾時(shí)間為8, 12和24 h時(shí)具有較高線性擬合度, 其中24 h時(shí)的線性響應(yīng)范圍最寬; 由圖6(B)可見, 電極修飾時(shí)間相對(duì)延長(如24 h)時(shí)響應(yīng)性能穩(wěn)定性和重現(xiàn)性更好. 因此, 選擇24 h作為電極的最佳修飾時(shí)間.

Fig.6 Typical potential response curves to L-Cys at different modification time(A) and effect of electrode sensitivity on modification time(B)(A) Modification time/h: a. 4; b. 8; c. 12; d. 24; d. 36; f. 48.

2.5 HS-β-CD/GE電極的最佳pH值

研究了在pH值分別為3.0, 4.0, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 8.0和9.0的PBS緩沖溶液條件下, HS-β-CD/GE電極電位隨L-Cys濃度的變化關(guān)系, 并依此求出響應(yīng)斜率, 繪制了不同pH條件下電位差隨濃度變化曲線以及斜率與pH關(guān)系曲線(圖7). 由圖7(A)可見, 該電極在弱酸性(pH=5.0～6.0)條件下對(duì)L-Cys的響應(yīng)靈敏度較一致, 當(dāng)pH=6.0時(shí), 其斜率值為(-65.29±1.0) mV/pc(25 ℃), 接近能斯特響應(yīng)斜率的理論值; 由圖7(B)可見, 電極在pH分別為5.0, 5.5和6.0時(shí)均具有良好的響應(yīng)線性關(guān)系, 而電極在pH=6.0時(shí)的響應(yīng)穩(wěn)定性、 檢測(cè)限等性能較好, 故選擇最佳的pH值為6.0.

Fig.7 Effect of electrode sensitivity on pH(A) and corresponding potential response curves for L-Cys at different pH values(B)(B) pH value: a. 3; b. 4; c. 5; d. 5.5; e. 6; f. 6.5; g. 7; h. 8 ; i. 9.

2.6 HS-β-CD/GE電極的響應(yīng)性能

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下, 考察了HS-β-CD/GE電極對(duì)L-Cys 的電位響應(yīng)性能. 圖8為該電極在PBS緩沖溶液(pH=6.0)中對(duì)濃度為1.0×10-10～1.0×10-4mol/L的L-Cys進(jìn)行檢測(cè)得到的電位響應(yīng)隨濃度變化的曲線圖. 可見, 隨著L-Cys 濃度的增大, 電極電位逐漸降低, 說明修飾電極表面鍵合的L-Cys數(shù)量增加, 且該電極與L-Cys濃度在1.0×10-7～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系, 采用最小二乘法擬合得到線性方程為ΔE=-65.29lgc-464.5, 根據(jù)作圖法[49]得到其檢測(cè)下限為6.0×10-8mol/L.

Fig.8 Potential response curve of HS-β-CD/GE to L-Cys in PBS(pH=6.0) with various concentrationsThe red lines are the fitted curves of potential change vs. logarithmic concentration of L-Cys.

2.7 響應(yīng)時(shí)間、 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

考察了HS-β-CD/GE電極對(duì)不同濃度L-Cys 檢測(cè)所得電位信號(hào)隨響應(yīng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化及其穩(wěn)定性情況. 圖9(A)為在PBS緩沖溶液(pH=6.0)中加入不同濃度(1.0×10-8～1.0×10-4mol/L)L-Cys后的動(dòng)態(tài)電位變化曲線圖. 可見, 在測(cè)試濃度范圍內(nèi)電極電位每次達(dá)到電位平衡的反應(yīng)時(shí)間均較短, 以達(dá)到電位響應(yīng)最大值的90%來計(jì)算[見圖9(B)], 其響應(yīng)時(shí)間為63 s, 表明該電極對(duì)L-Cys具有較快的響應(yīng)速度. 當(dāng)電位隨著時(shí)間的延長而逐漸趨向于穩(wěn)定時(shí), 加入下一個(gè)濃度進(jìn)行檢測(cè), 同時(shí)也說明電極的響應(yīng)性能穩(wěn)定. 隨后, 用該電極對(duì)濃度為1.0×10-6mol/L的L-Cys樣品連續(xù)監(jiān)測(cè)30 min, 電位漂移<±2.0 mV(n=11), 所得電位數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%, 表明該電位傳感器具有良好的穩(wěn)定性. 用該電極對(duì)L-Cys樣品檢測(cè)30 d后, 其響應(yīng)斜率為-77.4 mV/pc, 下降了18.56%, 說明該電極可以使用至少30 d, 具有較長的使用壽命.

Fig.9 Dynamic curve of HS-β-CD/GE responding to various concentration of L-Cys in PBS(pH=6.0)(A) and enlarged plot of stage G for 1.0×10-4 mol/L of L-Cys(B)c(L-Cys)/( mol·L-1): a. 1.0×10-8; b. 5.0×10-8; c. 1.0×10-7; d. 5.0×10-7; e. 1.0×10-6; f. 1.0×10-5; g. 1.0×10-4.

實(shí)驗(yàn)還考察了HS-β-CD/GE電極對(duì)不同濃度L-Cys樣品溶液的電位響應(yīng)重現(xiàn)性, 即對(duì)1.0×10-6和1.0×10-5mol/LL-Cys樣品溶液的電位響應(yīng)值分別測(cè)試6次, 結(jié)果如表1所示. 通過對(duì)數(shù)據(jù)的分析與處理發(fā)現(xiàn),L-Cys濃度不同時(shí)二者的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為±0.75和±1.05 mV, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.54%和1.31%, 可見二者的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均比較小, 說明該電極具有良好的重現(xiàn)性.

Table 1 Reproducibility of HS-β-CD/GE responding to L-Cys in PBS(pH=6.0)*

* AV: average; SD: standard deviation; RSD: relative standard deviation.

2.8 HS-β-CD/GE電極的選擇性

對(duì)于電位型電化學(xué)傳感器來說, 選擇性是評(píng)價(jià)其傳感性能的重要參數(shù), 也是判斷其能否實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)重要因素[31,50]. 采用混合溶液法考察了HS-β-CD/GE電極對(duì)L-Cys與19種豬血清和豬尿液中常見共存物質(zhì)混合溶液的電位響應(yīng)情況. 圖10為HS-β-CD/GE電極對(duì)濃度為1.0×10-6mol/LL-Cys檢測(cè)的電位值達(dá)到穩(wěn)定時(shí), 分別加入濃度為1.0×10-4mol/L的L-Val,L-Trp,L-Phe,L-Leu,L-Thr,L-Ala,L-Ile,L-Gly,L-Arg,L-Pro,L-Cyn,L-Met,L-His,L-Lys, Na+, K+, Ca2+, UA和GLC等19種組分后的電位變化柱狀圖. 可見, 僅在加入L-Cyn時(shí)電位值升高了(22±2) mV, 而加入100倍濃度其它13種氨基酸和Na+, K+, Ca2+, 尿酸和葡萄糖時(shí)電位值幾乎未發(fā)生變化, 即不干擾電極的測(cè)定.

Fig.10 Effects of interfering substance on HS-β-CD/GEThe concentration of L-Cys is 1.0×10-6 mol/L, and the concentrations of other coexisting substances are 1.0×10-4 mol/L. a. L-Cys; b. L-Cys+L-Val; c. L-Cys+L-Trp; d. L-Cys+L-Phe; e. L-Cys+L-Leu; f. L-Cys+L-Thr; g. L-Cys+L-Ala; h. L-Cys+L-Ile; i. L-Cys+L-Gly; j. L-Cys+L-Arg; k. L-Cys+L-Pro; l. L-Cys+L-Cyn; m. L-Cys+L-Met; n. L-Cys+L-His; o. L-Cys+L-Lys; p. L-Cys+Na+; q. L-Cys+K+; r. L-Cys+Ca2+; s. L-Cys+UA; t. L-Cys+GLC.

2.9 回收率測(cè)定與分析應(yīng)用

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下, 考察了HS-β-CD/GE電極對(duì)實(shí)際樣品如豬血清和豬尿液中L-Cys含量的檢測(cè)效果, 與HPLC分析結(jié)果基本一致(見表2). 同時(shí), 采用該電極對(duì)豬血清和豬尿液樣品進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定, 即在預(yù)處理的豬血清和豬尿液樣品中分別加入不同濃度的L-Cys, 測(cè)得的回收率結(jié)果如表2所示, 可見, 豬血清樣品的回收率為96.6%～104.7%, 豬尿液樣品的回收率為95.0%～101.6%, 2種樣品測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別小于5%和6%, 表明該自組裝膜電化學(xué)傳感器具有良好的準(zhǔn)確性, 且實(shí)用性強(qiáng), 可用于實(shí)際樣品中L-Cys含量的測(cè)定分析, 在生命科學(xué)、 生物醫(yī)學(xué)和畜禽健康養(yǎng)殖等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值.

Table 2 Recovery of the proposed HS-β-CD/GE for determination of L-Cys in pig serum and urine samples

a. Initial value was measured with HPLC(n=3), which was provided by Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences;b. the data was measured with the proposed HS-β-CD/GE electrode(n=3). --- represents not detected.

3 結(jié) 論

制備了單(6-巰基-6-去氧)-β-環(huán)糊精自組裝膜修飾金電極, 其對(duì)L-半胱氨酸(L-Cys)顯示出優(yōu)異的超分子識(shí)別作用, 膜電位響應(yīng)斜率為(-65.29±1.0) mV/pc, 檢測(cè)下限為60 nmol/L. 將該電極應(yīng)用于實(shí)際豬血清及豬尿液樣品中L-Cys的檢測(cè), 顯示出良好的準(zhǔn)確性和可行性. 該電位型電化學(xué)傳感器制作簡單、 響應(yīng)快速靈敏, 有望成為一種在線檢測(cè)L-Cys的新手段.