謝丹 文丹寧 羅丹

肺炎鏈球菌廣泛存在于自然界中，感染后可引起肺炎[1]。肺炎鏈球菌肺炎是呼吸系統(tǒng)主要疾病之一，嚴重影響患者的生活和健康。肺泡上皮細胞凋亡是肺炎發(fā)生發(fā)展的重要病理過程[2]。肺泡上皮細胞是覆蓋在肺泡上層的細胞，具有屏障保護功能，其在肺組織損傷修復過程中發(fā)揮重要作用[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，microRNA(miRNA)在多種疾病過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，重癥肺炎患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中miR-127-5p的表達量明顯低于肺呼吸道感染術后患者，miR-127-5p可作為診斷重癥肺炎的分子標志物[4]。白細胞介素1受體相關激酶4(Interleukin-1 receptor-related kinase 4，IRAK4)與多種炎癥性疾病密切相關，其在肝臟損傷中高表達，是內毒素信號傳導通路導致的肝臟損傷的重要因素[5]。但miR-127-5p和IRAK4在肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞中的表達及其對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響，且miR-127-5p是否通過靶向調控IRAK4的表達，影響肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子的表達，目前還尚未可知。本研究通過分子生物學技術探究miR-127-5p、IRAK4在肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞中的表達及其作用機制。

資料與方法

一、材料

肺泡上皮細胞A549購自中國科學院細胞庫，胰蛋白酶購自美國Sigma，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Trizol購自美國Ambion公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度試劑盒購自大連TAKARA公司，lipofectamine TM2000轉染試劑盒購自美國Santa Cruz公司，miR-127-5p minic和陰性對照序列miR-NC、si-IRAK4、si-NC、pcDNA-IRAK4、pcDNA-NC購自山東維真生物技術有限公司，ECL發(fā)光液購自美國R&D公司，IRAK4、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗購自美國CST公司，IgG二抗購自北京博奧森生物技術公司，白介素10(Interleukin 10，IL-10)、白介素6(Interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒購自上海紀寧生物科技有限公司。

二、實驗方法

1 細胞的培養(yǎng) 肺泡上皮細胞A549細胞置于含有10%胎牛血清和雙抗(100U/L青霉素、100mg/L鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，細胞密度達到80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化細胞，傳代培養(yǎng)。

2 實驗分組及處理 肺泡上皮細胞A549分為對照組、感染組，其中感染組細胞密度達到80%～90%時，使用1×108CFU/mL肺炎鏈球菌培養(yǎng)細胞[6]，對照組細胞正常培養(yǎng)。

3 載體構建及細胞轉染 構建miR-NC、miR-127-5p mimic、pcDNA-NC、pcDNA- IRAK4質粒。取對數(shù)生長期肺泡上皮細胞A549，調整細胞濃度為4×105個/mL，以每孔2mL接種于6孔板中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜，細胞密度達到60%作用時，棄去培養(yǎng)基，添加無血清培養(yǎng)基孵育1h；更換無血清培養(yǎng)基，使用lipofectamine TM2000分別將miR-NC、miR-127-5p mimic、si-IRAK4、si-NC轉染至A549細胞，獲得穩(wěn)定高表達miR-127-5p的A549細胞株；另外在穩(wěn)定高表達miR-127-5p 的A549細胞株的基礎上轉染pcDNA-NC、pcDNA- IRAK4，獲得穩(wěn)定高表達IRAK4的miR-127-5p mimic+pcDNA-IRAK4細胞株。肺炎鏈球菌刺激感染的細胞在轉染后48 h進行感染。

4 qRT-PCR檢測mRNA表達水平 收集細胞，提取細胞中總RNA，反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA進行qRT-PCR，miR-127-5p、IRAK4分別以U6、β-actin為內參基因，反應體系為20 uL：2×SYBR Mix10uL，上下游引物各0.5uL，10×cDNA模板1uL，H20 8uL。反應程序為95℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)。引物序列：miR-127-5p：F 3′-TTCCCACCTGCGGGGTG-5′，R 5′-TCTAGAGAAATCTTTGAATGCCAAG-3′；U6：F 5′-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；IRAK4 ：F 3′-GTCATGACCAGCCGAAT CGTG-5′，R 5′-CAGACACTGGTCAGCAGCAGA-3′；GAPDH：F 5′-TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC-3′，R 5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。采用 2-ΔΔct方法計算miR-127-5p、IRAK4的相對表達量，實驗重復3次取平均值。

5 western blot法檢測蛋白表達情況 收集細胞，加入含有PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA工作液測定蛋白濃度；SDS加熱變性蛋白；每孔加入40ug蛋白，SDS-PAGE凝膠跑膠；目的蛋白濕轉至PVDF膜；5%BSA室溫封閉1h，加入稀釋一抗4℃孵育過夜，TBS洗3次/5 min；二抗室溫孵育1 h，TBS洗3次/5 min；ECL顯色液，AI600凝膠成像儀采集圖片，Image ProPlus軟件進行灰度分析，GAPDH為內參進行灰度值比較。

6 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 收集處理后細胞，預冷PBS清洗3次，加入500 μL 1×Binding Buffe制備1×106個/mL細胞懸液，然后按順序加入10 μL PI和5 μL Annexin V-FITC，避光放置5min，流式細胞儀檢測凋亡細胞情況。

7 雙熒光素酶實驗檢測miR-127-5p 對IRAK4的影響 構建野生型IRAK4-3’UTR(WT-IRAK4 3’UTR)和突變型IRAK4-3’UTR(MUT-pGL3-IRAK4-3’UTR)質粒，lipofectamine TM2000轉染至miR-con、miR-127-5p A549細胞中，轉染后48 h檢測熒光強度。

8 ELISA檢測IL-10、IL-6水平 收集待檢測組培養(yǎng)24 h的細胞培養(yǎng)液上清，按照試劑盒說明書，采用ELISA檢測IL-10、IL-6水平。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、肺炎鏈球菌感染對肺泡上皮細胞中miR-127-5p和IRAK4表達的影響

與對照組比較，肺炎鏈球菌感染后感染組A549細胞中miR-127-5p表達水平顯著降低，IRAK4 mRNA及蛋白水平顯著升高。P<0.05(圖1，表1)。

圖1 IRAK4蛋白表達

表1 肺炎鏈球菌感染對肺泡上皮細胞中miR-127-5p和IRAK4表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05

二、miR-127-5p過表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

與對照組比較，肺炎鏈球菌感染后感染組A549細胞中miR-127-5p表達水平顯著降低，凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax蛋白水平顯著升高，炎癥因子IL-10水平降低，IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與感染+miR-NC組比較，過表達miR-127-5p后，A549細胞中miR-127-5p表達水平顯著升高，凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高，Bax蛋白水平顯著降低，炎癥因子IL-10水平升高，IL-6水平顯著降低，P<0.05(見圖2，表2)。

圖2 miR-127-5p過表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡的影響

表2 miR-127-5p過表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與感染+miR-NC組比較，#P<0.05

三、抑制IRAK4表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

與對照組比較，肺炎鏈球菌感染后感染組A549細胞中IRAK4表達水平顯著升高，凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax蛋白水平顯著升高，IL-10水平降低，IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與感染+si-NC組比較，抑制IRAK4表達后，A549細胞中IRAK4水平顯著降低，凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高，Bax蛋白水平顯著降低，IL-10水平升高，IL-6水平顯著降低，P<0.05(見圖3，表3)。

圖3 IRAK4和凋亡相關蛋白表達

表3 抑制IRAK4表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與感染+si-NC組比較，#P<0.05

四、miR-127-5p靶向調控IRAK4的表達

TargetScan生物信息學數(shù)據(jù)庫檢索顯示，miR-127-5p與IRAK4 3’UTR存在互補序列(圖4A)。雙熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC-WT-IRAK4比較，miR-127-5p-WT-IRAK4組雙熒光素酶活性顯著降低，miR-NC-MUT-IRAK4與miR-127-5p-MUT-IRAK4組無顯著差異，提示miR-127-5p與直接與IRAK43’UTR區(qū)域特異性結合(表4)。進一步驗證miR-127-5p與IRAK4的關系，Western blot結果顯示，過表達miR-127-5p的A549細胞中IRAK4蛋白水平顯著下降，抑制miR-127-5p的A549細胞中IRAK4蛋白水平顯著升高(圖4B，表5)，進一步證實了miR-127-5p可通過與IRAK4特異性結合負向調控IRAK4的表達。

圖4 miR-127-5p靶向調控IRAK4的表達

A: IRAK4的3’UTR中含有與miR-127-5p互補的核苷酸序列；B: IRAK4蛋白表達

表4 雙熒光素酶報告實驗

注：與miR-NC組比較，*P<0.05

五、IRAK4過表達逆轉了miR-127-5p過表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的作用

與miR-NC組比較，過表達miR-127-5p后，A549細胞中IRAK4蛋白表達水平顯著降低，凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高，Bax蛋白水平顯著降低，IL-10水平升高，IL-6水平顯著降低(P<0.05)；與感染+miR-127-5p+pcDNA組比較，感染+miR-127-5p+pcDNA-IRAK4組A549細胞中IRAK4水平顯著升高，凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax蛋白水平顯著升高，IL-10水平降低，IL-6水平顯著升高，P<0.05(見圖5，表6)。

表5 miR-127-5p調控IRAK4蛋白的表達

注：與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05

圖5 IRAK4和凋亡相關蛋白表達

討 論

肺炎是臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病，肺炎鏈球菌是導致肺炎的主要病原菌。肺泡上皮細胞可合成、分泌細胞因子，調節(jié)肺泡表面張力，參與肺部炎癥反應[7]。肺炎鏈球菌感染后，肺泡上皮細胞出現(xiàn)結構與功能的變化，細胞凋亡增加，局部生理機能喪失[8]。肺泡上皮細胞的凋亡是導致細胞防御功能喪失、機體抗感染能力下降的重要原因[9]。

研究顯示，肺泡上皮細胞A549細胞的凋亡率與肺炎鏈球菌呈時間依賴性增加[10]。細胞凋亡過程涉及線粒體信號通路、死亡受體信號通路，其中線粒體信號通路中的Bcl-2/Bax在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[11]。Bax、Bcl-2均是Bcl-2基因家族成員，Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bax在線粒體應激信號通路的細胞凋亡中具有關鍵作用，其既拮抗Bcl-2的抗凋亡作用，又促進細胞凋亡[12-13]。細胞中Bax多以單體形式存在于胞漿中，Bax從細胞漿中轉移到線粒體膜后與Bcl-2結合形成異二聚體，Bax表達升高可抑制Bcl-2的凋亡抑制作用進而促進細胞凋亡[14]。本研究結果顯示，肺炎鏈球菌感染后，細胞凋亡率增加，Bax水平顯著升高、Bcl-2水平下降，提示細胞凋亡在肺炎鏈球菌肺炎病理過程中發(fā)揮重要作用。肺炎鏈球菌感染肺泡上皮細胞后引起細胞因子合成、分泌的改變，促炎因子和抗炎因子在炎癥性疾病中發(fā)揮相反作用。研究報道，促炎因子IL-6隨著肺炎鏈球菌刺激時間的延長表達增加，而抗炎因子IL-10水平與刺激時間呈負相關[15]。本研究結果顯示，肺炎鏈球菌感染后A549細胞中IL-10水平顯著降低，IL-6水平顯著升高，提示肺炎鏈球菌感染引起炎癥反應。

表6 IRAK4過表達逆轉了miR-127-5p過表達對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞凋亡和炎癥因子表達的作用

注：與感染+miR-NC組比較，*P<0.05；與感染+miR-127-5p+pcDNA組比較，#P<0.05

miRNA是一類大小約20～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，其通過與靶基因特異性結合，調控基因的表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程。miR-127-5p在多種炎癥損傷性疾病中異常表達，研究表明，miR-127-5p在骨關節(jié)炎軟骨細胞中的表達顯著低于正常軟骨細胞，miR-127-5p高表達可促進軟骨細胞增殖，抑制炎性反應[16]。與健康大鼠相比，miR-127在2型糖尿病大鼠中表達下調，過表達miR-127，可抑制糖尿病炎性疾病的發(fā)展[2,17]。miR-127-5p在肺炎患者中的表達，被證明可作為重癥肺炎的分子標志物[4]。本研究結果顯示，miR-127-5p在肺炎鏈球菌感染后A549細胞中表達下調，過表達miR-127-5p后，A549細胞中細胞凋亡率降低、Bax、IL-6顯著降低，Bcl-2、IL-10水平顯著升高，提示過表達miR-127-5p可抑制肺炎鏈球菌引起的細胞凋亡與炎性因子的分泌。

IRAK4與多種炎癥性疾病密切相關，高糖條件下，心肌細胞中IRAK4蛋白顯著上調，沉默IRAK4 可顯著抑制高糖誘導的心肌細胞的凋亡，提高細胞的活力，其可能通過調節(jié)NF-kB活性及其下游炎癥介質的表達發(fā)揮作用[5,18]。抑制IRAK4的表達是脂多糖預處理減輕肝臟缺血再灌注損傷的重要機制之一[6,19]。腦缺血性損傷早期大鼠額頂葉皮層組織IRAK-4表達水平迅速上調，早期抑制其功能可發(fā)揮有效的腦保護作用[7,20]。本研究結果顯示，肺炎鏈球菌感染后A549細胞中IRAK4水平顯著升高，提示其可能參與肺炎疾病過程。抑制IRAK4表達后，A549細胞中細胞凋亡率、IRAK4、IL-6水平顯著降低，IL-10水平顯著升高，提示抑制IRAK4可抑制肺炎鏈球菌引起的細胞凋亡與炎性因子分泌失衡。

生物信息學預測顯示，miR-127-5p與IRAK4 3’UTR區(qū)域存在互補序列，雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-127-5p與IRAK4可直接結合；Western blot進一步證實，miR-127-5p可通過與IRAK4直接結合負向調控IRAK4的表達。進一步驗證miR-127-5p與IRAK4在肺炎鏈球菌感染中的作用，在穩(wěn)定過表達miR-127-5p的感染細胞中轉染pcDNA-IRAK4，結果顯示，A549細胞中凋亡率、IRAK4、Bax、IL-6水平顯著升高，Bcl-2、IL-10水平顯著降低，提示過表達IRAK4可逆轉miR-139-5高表達對A549細胞的保護作用。

綜上所述，本文初步探討miR-127-5p與IRAK4在肺炎鏈球菌感染中的作用及機制，可為臨床治療提供理論依據(jù)。