張艷琳 熊昊

肺炎鏈球菌是一種常見的呼吸道感染或醫(yī)院獲得性感染致病菌，當(dāng)人體的抵抗力下降時(shí)，可引發(fā)鼻竇炎、中耳炎、腦膜炎等疾病，其對(duì)于嬰幼兒和老年人的致病率更高。近年來，臨床開始使用肺炎鏈球菌疫苗來預(yù)防肺炎鏈球菌的感染，根據(jù)不同的血清型來選擇合理的疫苗，可更加有效地降低肺炎鏈球菌的感染率[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌毒力相關(guān)因子在致病菌引發(fā)侵襲性感染過程中發(fā)揮著重要作用[2]，對(duì)毒力基因的研究可為研制更加穩(wěn)定有效的肺炎鏈球菌疫苗提供可靠依據(jù)。目前，相關(guān)學(xué)者對(duì)肺炎鏈球菌毒力基因的類型及臨床分布情況進(jìn)行了初步研究，但對(duì)國內(nèi)肺炎鏈球菌毒力基因的類型及其與血清型關(guān)系的研究則較為鮮見?；诖耍狙芯繉?duì)本地區(qū)分離出的126株肺炎鏈球菌進(jìn)行血清分型，并對(duì)其毒力基因類型和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，分析其相互之間的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、菌株來源及試劑

收集宜賓市第二人民醫(yī)院于2015年3月-2018年12月間從臨床感染患者中分離的肺炎鏈球菌126株，分別來自門診患者(19株)、兒科患者(33株)、ICU患者(31株)、耳鼻喉科患者(21株)和其他科室患者(22株)；其中，來自血液培養(yǎng)7株，來自痰培養(yǎng)114株，來自分泌物培養(yǎng)3株，來自腦脊液培養(yǎng)2株。分型抗血清來自日本生研公司，PCR和q-PCR相關(guān)試劑購自上海威奧生物科技有限公司，DNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司。

二、方法

細(xì)菌DNA提取后，按照文獻(xiàn)[3]中具體步驟要求運(yùn)用多重PCR進(jìn)行肺炎鏈球菌株血清分型。

毒力基因檢測。細(xì)菌DNA提取后，按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列和長度(見表1)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系含有dNTP(10mmol/L)2μL，DNA模板2μL，buffer(含Mg2+濃度1.5mmol/L)2μL，上下游引物(10μM)各1.5μL，Tag酶(每微升含5個(gè)單位)0.8μL，底物1μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min后進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，主循環(huán)包括95℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸60s，循環(huán)結(jié)束后延伸72℃5min。應(yīng)用1%的瓊脂糖凝膠電泳后對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。

表1 5個(gè)毒力基因普通PCR所用引物

毒力基因轉(zhuǎn)錄水平檢測。按照RNA的提取試劑盒說明書提取總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，毒力基因引物序列和長度(見表2)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系含有cDNA模板2μL，dH2O 6μL，Premix Ex TaqⅡ10μL，上下游引物(10μM)各0.8μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性1min后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，主循環(huán)包括：94℃條件下進(jìn)行30s變性，55℃條件下進(jìn)行40s退火，72℃條件下進(jìn)行60s延伸。毒力基因轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)用法進(jìn)行計(jì)算。

表2 毒力基因定量PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、血清型檢測結(jié)果

126株肺炎鏈球菌中，血清19F型 27株(21.43%)，3型21株(16.7%)，23F型 16株(12.7%)，6A/B型14株(11.1%)，14型11株(8.7%)，19A型7株(5.6%)，15A型4株(3.2%)，此外有26株(20.6%)未能定型。

二、毒力基因檢測結(jié)果

126株肺炎鏈球菌中，毒力基因lytA陽性 115株(91.3%)，ply陽性 118株(93.7%)，nanA陽性 120株(95.2%)，psaA陽性 112株(88.9%)，cbpA陽性 114株(90.5%)(見圖1～5)。

圖1 psaA毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

圖2 nanA毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

圖3 ply毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

圖4 lytA毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

圖5 cbpA毒力基因片段PCR電泳結(jié)果

三、不同血清型的毒力基因攜帶分布

7種常見血清型中，23F型、14型、15A型、19F型的毒力基因攜帶率較高；并且每種血清型中nanA 的攜帶率均不低于其他類型毒力基因，且lytA、ply、nanA、psaA、cbpA毒力基因在7種常見血清型中的陽性率總體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(見表3)。

表3 不同血清型的5種毒力基因陽性率

四、不同血清型的毒力基因轉(zhuǎn)錄水平比較

lytA基因轉(zhuǎn)錄水平在不同血清型之間無明顯差異(P>0.05)，3型血清型的nanA、ply、psaA和cbpA基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于19F、23F、6A/B、14、19A血清型(P均<0.05)(見表4)。

表4 不同血清型的5種毒力基因轉(zhuǎn)錄水平

注：與19F、23F、6A/B、14、19A型比較，*P<0.05。

討 論

肺炎鏈球菌作為一種常見的病原菌經(jīng)常存在于人體的鼻咽部，人體攜帶時(shí)可暫時(shí)不致病，但當(dāng)?shù)挚沽档蜁r(shí)，細(xì)菌會(huì)向身體其他部位擴(kuò)散而導(dǎo)致鼻竇炎、中耳炎、肺炎、腦膜炎等疾病[2]。肺炎鏈球菌的血清型會(huì)根據(jù)地域的不同而產(chǎn)生變化。王穎童等[4]收集河北省兒童醫(yī)院的肺炎鏈球菌進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)最常見的血清型包括19F型、19A型、6A/B型、14型和1型。在本研究檢測的126株肺炎鏈球菌中，血清19F型 27株(21.43%)，3型21株(16.7%)，23F型 16株(12.7%)，6A/B型14株(11.1%)，14型11株(8.7%)，19A型7株(5.6%)，15A型4株(3.2%)，與上述河北地區(qū)的研究結(jié)果不完全相符，表明肺炎鏈球菌血清型分布具有一定的地區(qū)差異。

在肺炎鏈球菌的毒力基因中，lytA自溶素基因檢測的特異性最高，所以最適合用來鑒別肺炎鏈球菌。Ply具有一定的細(xì)胞毒性，可以通過抑制纖毛的定向擺動(dòng)促進(jìn)細(xì)菌向肺部遷移并侵入到血液中。本研究中的126株肺炎鏈球菌中，nanA、ply、lytA基因的陽性率分別達(dá)到95.2%、93.7%、91.3%，與國外報(bào)道的肺炎鏈球菌毒力基因檢測效果基本一致[5]。psaA是一種金屬結(jié)合脂蛋白，在肺炎鏈球菌中具有抗氧化應(yīng)激和降低補(bǔ)體活性的作用[6]。cpba在肺炎鏈球菌中發(fā)揮著重要的黏附作用，促使病原菌進(jìn)一步滲透入周圍的細(xì)胞組織[7]。nanA是一種神經(jīng)氨酸酶，是肺炎鏈球菌中的主要致病因子，也是公認(rèn)的藥物有效治療的靶向因子，可有效反映細(xì)菌的增殖和擴(kuò)散[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常見血清型中，23F型、14型、15A型、19F型的毒力基因攜帶率高于其他血清類型；并且每種血清型中nanA 的攜帶率均大于或等于其他毒力基因，表明nanA在不同血清型肺炎鏈球菌的常見毒力基因中具有最高的檢出率，可作為首要的治療和防疫靶向因子。

分析不同血清型肺炎鏈球菌的毒力基因轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同血清型的lytA基因轉(zhuǎn)錄水平之間無明顯差異(P>0.05)，3型肺炎鏈球菌的nanA、ply、psaA和cbpA基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于其他血清型(P均<0.05)。主要原因是，3型肺炎鏈球菌在增殖的過程中會(huì)產(chǎn)生更多的莢膜多糖，進(jìn)而形成更強(qiáng)的抗吞噬功能；此外，3型肺炎鏈球菌更容易進(jìn)入腦脊液進(jìn)而引發(fā)炎癥，導(dǎo)致毒性基因的轉(zhuǎn)錄水平升高。但本研究的不足之處在于未能對(duì)不同血清型肺炎鏈球菌體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平的差異進(jìn)行研究，這在今后的研究中還需要進(jìn)一步補(bǔ)充完善。

綜上所述，lytA、ply、nanA、psaA、cbpA毒力基因在7種常見血清型肺炎鏈球菌中普遍存在，血清型不同，其毒力基因的檢出率也存在不同程度的差異。