石瑞瑞 王曉軍

肺腺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，近年其發(fā)病率呈升高趨勢。浸潤性腺癌是病變進(jìn)展的結(jié)果，其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。近年學(xué)者關(guān)注分子表達(dá)異常與腫瘤形成的關(guān)聯(lián)性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)可能是對腫瘤的形成有重要作用[1]。我們在miRNA基因庫中進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)miR-147可能與肺腺癌相關(guān)，其可能具有調(diào)節(jié)增殖、轉(zhuǎn)移及血管形成的作用[2]。因此我們應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測肺腺癌中miR-147的表達(dá)，關(guān)注其與細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮生長因子的關(guān)系，探討miR-147與患者的預(yù)后的關(guān)系，以其為研究肺腺癌的形成和進(jìn)展提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

資料與方法

一、臨床資料

選取2015年01月-2015年07月期間的65例肺腺癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首診患者，且符合WHO中肺浸潤性腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理醫(yī)生復(fù)核切片確診；②臨床隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷不明確的患者；②肺部手術(shù)史；③合并嚴(yán)重感染的患者。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)同意，并符合赫爾辛基宣言中的相關(guān)要求。患者或家屬簽訂知情同意書。本組中男35例，女30例，年齡42～87歲，平均66.2±11.9歲。選擇腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫物邊緣>5 cm的正常肺組織作為對照組。均留取術(shù)后新鮮組織(-80度冰箱保存)和石蠟包埋組織。

二、方法

1 miR-147的檢測方法 應(yīng)用新鮮凍存標(biāo)本進(jìn)行miR-147的檢測。檢測方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。首先提取組織中的總RNA。miR-147引物設(shè)計(jì)：上游：5＇-CTATCGGGAACGACCG-3＇，下游：5＇-ACACATTGAAGGTCCCCTT-3＇。應(yīng)用U6作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)設(shè)定：95℃ 5 分鐘，循環(huán)1次；95℃ 25秒，64℃ 20秒，72℃ 20秒，15個(gè)循環(huán)；93℃ 25秒，60℃ 35秒，72℃ 20秒，35個(gè)循環(huán)。于60℃時(shí)收集熒光信號，記錄Ct值。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知樣品)-CtGAPDH(未知樣品)]-[Ct目的基因(校正樣品)-CtGAPDH(校正樣品)]。

2 免疫組化方法 Ki67和VEGF的試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。二者的檢測應(yīng)用免疫組化二步法、DAB顯色。Ki67的表達(dá)部位是細(xì)胞核，選擇腫瘤細(xì)胞表達(dá)較為明顯的3個(gè)高倍(400倍)視野區(qū)域計(jì)算陽性率，取平均值。以Ki67的陽性率作為增殖指數(shù)。VEGF的評估方法：陽性部位為細(xì)胞質(zhì)，選取3個(gè)高倍(400倍)視野，分別進(jìn)行陽性率和著色強(qiáng)度的計(jì)分。陽性率：≤25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。著色強(qiáng)度：無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。二者相乘作為最終評分，分值為0～12分。均由病理醫(yī)師采用盲法進(jìn)行判讀。

三、統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SAS6.12進(jìn)行分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)、配對t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)、方差分析、線性相關(guān)分析及K-M生存分析，以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、二組中miR-147表達(dá)的比較

二組中miR-147的表達(dá)量差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即觀察組中miR-147的表達(dá)量明顯低于對照組(見表1，圖1)。

表1 二組中miR-147表達(dá)的比較

圖1 二組中miR-147表達(dá)的柱狀圖

二、 觀察組不同臨床病理特征中miR-147表達(dá)比較

觀察組中miR-147的表達(dá)在有無胸膜累犯、不同腫瘤最大徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不同TNM分期的表達(dá)中差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在不同性別、年齡、分化程度的表達(dá)中差別無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

表2 不同臨床病理特征中miR-147表達(dá)比較

三、觀察組中miR-147與增殖指數(shù)的關(guān)系

應(yīng)用Pearson相關(guān)分析顯示觀察組中miR-147的表達(dá)與增殖指數(shù)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.48，P=0.022)。(見圖2，3)。

圖2 肺腺癌中Ki67的表達(dá)(IHC 200倍)

圖3 miR-147與增殖指數(shù)的關(guān)系

四、觀察組中miR-147與VEGF的關(guān)系

應(yīng)用Pearson相關(guān)分析顯示觀察組中miR-147的表達(dá)與VEGF呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.45，P=0.031)。(見圖4，5)。

圖4 肺腺癌中VEGF的表達(dá)(IHC 200倍)

圖5 miR-147與VEGF的關(guān)系

五、miR-147與生存時(shí)間的關(guān)系

患者隨訪的生存時(shí)間為7～48個(gè)月(48個(gè)月為終點(diǎn)時(shí)間)，共有2例失訪，中位生存時(shí)間29個(gè)月。生存分析顯示miR-147與生存時(shí)間有關(guān)(χ2=6.54，P<0.05)，即miR-147低表達(dá)患者的生存時(shí)間短，預(yù)后差。(見圖6)。

圖6 miR-147與生存時(shí)間的關(guān)系

討 論

近年微小RNA與腫瘤作用是研究的熱點(diǎn)，其主要在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用。微小RNA可以通過結(jié)合靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)引起翻譯的抑制，直接調(diào)節(jié)腫瘤的增殖[3]。miR-147的異常表達(dá)與上皮源性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。相關(guān)研究表明miR-147可能具有抑癌基因的作用[4]。柳家榮[5]等通過觀察miR-147在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-147可以靶向MDM2的表達(dá)，其過表達(dá)狀態(tài)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡。肺浸潤性腺癌是高增殖性腫瘤，細(xì)胞增生明顯，預(yù)后差，微小RNA異常表達(dá)其發(fā)生密切相關(guān)。

本研究基于肺腺癌術(shù)后組織進(jìn)行研究，結(jié)果顯示肺腺癌中miR-147的表達(dá)明顯低于對照組，提示miR-147低表達(dá)是腫瘤形成的分子因素，miR-147發(fā)揮抑癌基因作用，miR-147在細(xì)胞的異型增生過程的作用明顯，對調(diào)控細(xì)胞的失控性增生有較為明顯的作用。結(jié)果顯示肺腺癌中miR-147的表達(dá)與有無胸膜累犯、不同腫瘤最大徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-147低表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的侵襲、生長和轉(zhuǎn)移，腫瘤處于進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。結(jié)果顯示miR-147的表達(dá)與不同TNM分期有關(guān)，由于TNM分期提示腫瘤的預(yù)后和生物學(xué)行為，因此miR-147的表達(dá)可能與腫瘤的預(yù)后和判斷腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)。生存分析直接證實(shí)了此結(jié)論，即miR-147低表達(dá)患者的預(yù)后差。低表達(dá)的miR-147預(yù)示著腫瘤較高的臨床分期。結(jié)果顯示miR-147的表達(dá)與增殖指數(shù)呈負(fù)相關(guān)性，提示miR-147低表達(dá)時(shí)可以引起腫瘤細(xì)胞的異常增殖。miR-147的異常表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的失控性增生，引起腫瘤迅速生長，腫瘤體積增大，侵襲性增強(qiáng)[6]。miR-147對細(xì)胞增殖是直接作用，其受到明顯抑制后的作用也可能與對增殖相關(guān)基因有關(guān)，如PCNA和CyclinD1等[7]。結(jié)果顯示miR-147的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，提示miR-147低表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)的血管生成，使局部的營養(yǎng)和氧的供應(yīng)增加，腫瘤細(xì)胞生長活躍[8]。體外研究顯示miR-147高表達(dá)時(shí)對細(xì)胞周期可出現(xiàn)明顯的抑制，有學(xué)者將miR-147轉(zhuǎn)染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，位于G0/G1期的細(xì)胞比例升高，細(xì)胞的增殖程度下調(diào)，凋亡因子表達(dá)升高，腫瘤呈抑制的狀態(tài)[5]。此結(jié)果與本研究結(jié)果的結(jié)論相似。miR-147可能對EGFR和TGF有明確的抑制作用，EGFR和TGF 可能是miR-147的下游因子，其活化后具有較強(qiáng)的臨床意義[9-10]，這也是miR-147對腫瘤調(diào)節(jié)作用之一。也有學(xué)者通過miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetScan和miRecords發(fā)現(xiàn)miR-147的靶基因可能更多[11-12]，如整合素分子，因此miR-147的作用可能通過整合素介導(dǎo)的生物學(xué)通路發(fā)揮生物學(xué)作用，促進(jìn)腫瘤的侵襲和進(jìn)展，這個(gè)通路使miR-147在腫瘤促進(jìn)作用中，也有對轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。miR-147也可能與炎癥反應(yīng)因子及巨噬細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)，尤其是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的功能。這也提示miR-147的作用可能更復(fù)雜[13]。因此對miR-147的研究不應(yīng)當(dāng)局限于某一個(gè)靶位或某幾個(gè)分子，對其進(jìn)行多種基因的篩查及關(guān)聯(lián)性研究可能是揭示miR-147具體意義的重要方法，也可能為針對miR-147的靶向治療提供重要參考指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的miR-147與生存時(shí)間的關(guān)系，需要后續(xù)進(jìn)行多中心、大樣本及多因素的分析證實(shí)。

總之，肺腺癌中miR-147低表達(dá)是肺腺癌形成的重要分子事件，其參與腫瘤的進(jìn)展，miR-147的作用與對細(xì)胞增殖和VEGF的調(diào)節(jié)有關(guān)，miR-147的表達(dá)可能與預(yù)后有關(guān)。