黃小龍 萬姍

肺癌屬于一種嚴(yán)重威脅著人類生命健康的惡性腫瘤之一，是癌癥死亡的主要原因，其發(fā)病率和死亡率與其他惡性腫瘤相比居于首位，大約占全部惡性腫瘤的20%左右[1]。目前臨床上迫切需要解決的問題為需要有效的治療肺癌的方案，但由于肺癌的復(fù)發(fā)、多藥耐藥以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等增加了肺癌的治療難度，嚴(yán)重影響著肺癌患者生命安全[2]。CD133基因是位于人類4號(hào)染色體上，包含有37個(gè)外顯子，屬于細(xì)胞膜蛋白的超家族成員，含有8665個(gè)氨基酸，其分子質(zhì)量為120ku[3]。EGFR屬于一種表皮生長(zhǎng)因子的受體，其所介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞的增殖、分化、生存具有一定的相關(guān)性[4]。吉非替尼屬于一種選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑，酪氨酸激酶抑制劑屬于肺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，且對(duì)于突變型的非小細(xì)胞肺癌的治療效果較好[5]。吉非替尼是通過選擇性的抑制EGFR-TK所介導(dǎo)的信號(hào)傳遞通路發(fā)揮其作用[6]。因此在本文中設(shè)想利用CD133、EGFR在肺癌組織中的表達(dá)特性來，對(duì)肺癌細(xì)胞進(jìn)行雙靶向處理，以研究雙靶向吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的作用。

資料與方法

一、材料

研究細(xì)胞：肺癌A549細(xì)胞、A431細(xì)胞(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)，本次研究經(jīng)過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑：吉非替尼(大連梅倫生物技術(shù)公司)；生理紅蛋白標(biāo)記的CD133、EGFR抗體和CD133、EGFR微珠套件(Miltenyi Biotec公司)。

二、方法

1 吉非替尼納米載體的制備 首先將10 mg磷脂聚乙二醇嵌段共聚物和2 mg吉非替尼溶解于5 mL氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉氯仿后，加入5 mL的磷酸鹽緩沖液水化磷脂膜，并通過聚碳酸脂膜過濾后獲得吉非替尼納米載體。

2 雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體的制備 參照文獻(xiàn)[7]制備雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體，通過碳化二亞胺法制備靶向納米載體，將CD133核酸適體(0.05 mg)、EGFR核酸適體(0.05 mg)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺，0.02 mg)、NHS(N-羥基丁二酰亞胺，0.02mg)加入到1mL上述獲得的納米載體中，在磁力攪拌條件下室溫孵育。加入純水離心到一定體積，通過15 mL的超濾離心柱(截留分子量為100kDa)除掉游離EDC和NHS以及游離狀態(tài)的核酸適體，獲得雙靶向吉非替尼納米載體。CD133或EGFR單靶向或無靶向的吉非替尼納米載體制備方法同上。

3 吉非替尼載藥量和包封率的測(cè)定 取冷凍干燥納米載體并稱重。再將其溶解于乙腈后，采用C18色譜柱，磷酸氫二鉀/甲醇(10/90，v/v)，流速1.5mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)246nm，20μL進(jìn)樣高效液相色譜儀測(cè)定納米載體吉非替尼含量，由此計(jì)算吉非替尼載藥量和包封率。包封率的計(jì)算方法：包封率是指包入納米載體內(nèi)的藥物量與投料量的重量百分比，包封率=W包/W投*100%(W包指包裹進(jìn)入的吉非替尼的質(zhì)量；W投指投入的吉非替尼的總質(zhì)量)。載藥量的計(jì)算方法：載藥量是指一定重量的納米載體所包封的藥物重量百分比，載藥量=W包/W納米載體*100%(W包指包裹進(jìn)入的吉非替尼的質(zhì)量；W納米載體指處方納米載體的總質(zhì)量)。

4 納米載體的粒徑及zeta電位的測(cè)定 分別取5μL的納米載體溶液或稀釋溶液(視情況可能需要用MilliQ水稀釋)，加入到100目的銅網(wǎng)。當(dāng)室溫蒸干水分后，樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸鹽酸溶液染色，通過透射電鏡觀測(cè)納米載體的粒徑及粒徑分布。取5μL的納米載體溶液，用1mL的MilliQ水稀釋后，直接用馬爾文粒徑儀測(cè)定納米載體的粒徑和zeta電位。

5 吉非替尼釋放測(cè)定 將2mg的納米載體分別重懸在5 mL PBS中，放置在恒溫水浴搖床中(37℃，100 rpm)，在特定時(shí)間點(diǎn)時(shí)，將4mL納米載體溶液在11500 rpm離心45min后，將上清取出揮干，經(jīng)乙腈溶解后用HPLC測(cè)定吉非替尼含量，再加入等量的新鮮PBS溶液繼續(xù)測(cè)定釋放。

6 肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)與干細(xì)胞分選 在37℃孵箱中，以10%胎牛血清培養(yǎng)肺癌A549和A431細(xì)胞系。分別加入FITC標(biāo)記的抗CD133抗體到以上消化后的細(xì)胞株，加PBS溶液，洗滌離心，流式上機(jī)，計(jì)算陽性百分率和平均熒光強(qiáng)度。以CD133免疫磁珠分選出CD133陽性的肺癌細(xì)胞，

7 雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體在肺癌細(xì)胞中的蓄積效率 將5×104肺癌細(xì)胞鋪板，在CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)過夜。將一定濃度的納米載體分別加入單層細(xì)胞中，繼續(xù)分別培養(yǎng)4小時(shí)，清洗并收集細(xì)胞至離心管中，超聲粉碎細(xì)胞后離心，取出上清并揮干，經(jīng)乙腈溶解后用高效液相色譜測(cè)定吉非替尼含量，評(píng)價(jià)納米載體在肺癌細(xì)胞內(nèi)的蓄積效率。

8 雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體對(duì)肺癌細(xì)胞克隆球生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞，用PBS洗干凈后胰酶消化，離心。采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。接種，加入納米載體，剩余1個(gè)孔不做處理。孵育，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)。在7天時(shí)，計(jì)數(shù)肺癌細(xì)胞克隆球形成數(shù)?？寺∏蛐纬陕?微球體個(gè)數(shù)/接種的單個(gè)細(xì)胞數(shù)×100%。

9 雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體對(duì)肺癌細(xì)胞殺傷作用 取肺癌細(xì)胞系細(xì)胞，在96孔板中鋪板，100μL/孔(3×103/孔)，每種細(xì)胞93個(gè)孔(3個(gè)孔為未處理組；另外90個(gè)孔作為實(shí)驗(yàn)組，共10個(gè)濃度，3個(gè)復(fù)孔，3種藥物)，在37℃，5%CO2中培養(yǎng)過夜。兩倍比稀釋納米載體以及游離吉非替尼分別加入細(xì)胞中。培養(yǎng)72小時(shí)，通過CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，讀取450nm處吸光度，計(jì)算各藥物組的IC50值。細(xì)胞生存率計(jì)算公式：(實(shí)驗(yàn)組OD450-空白組OD450)/(未處理組OD450-空白組OD450)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、不同載藥納米載體包封率、載藥量、粒徑、zeta電位比較

雙靶向吉非替尼納米載體組包封率、粒徑均高于吉非替尼納米載體組，載藥量、zeta電位低于吉非替尼納米載體組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05(見表1)。

表1 兩種載藥納米載體包封率、載藥量、粒徑、zeta電位比較

二、不同載藥納米載體圖

圖1 不同載藥納米載體圖

三、 包裹吉非替尼后透射電鏡圖

吉非替尼納米載體膠束的透射電鏡圖，由圖可知，納米載體的粒徑大小較為均勻，形態(tài)呈現(xiàn)為球形。雙靶向吉非替尼納米載體膠束的透射電鏡圖，由圖可知，納米載體的粒徑大小較為均勻，形態(tài)呈現(xiàn)為球形，分散性較佳(見圖2)。

圖2 包裹吉非替尼后透射電鏡圖

四、 不同載藥納米載體中的吉非替尼釋放量比較

兩組載藥納米載體中的吉非替尼在各時(shí)間點(diǎn)的釋放量比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05(見表2)。

表2 不同載藥納米載體中的吉非替尼釋放量比較(%)

五、不同載藥納米載體在肺癌細(xì)胞內(nèi)的蓄積效率比較

雙靶向吉非替尼納米載體組在肺癌A549細(xì)胞、A431細(xì)胞中的蓄積效率均高于吉非替尼納米載體組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05(見表3)。

表3 不同載藥納米載體在肺癌細(xì)胞內(nèi)的蓄積效率比較(%)

六、不同載藥納米載體對(duì)肺癌細(xì)胞克隆球形成的影響

雙靶向吉非替尼納米載體組肺癌A549細(xì)胞、A431細(xì)胞克隆球形成率均低于吉非替尼納米載體組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05(見表4)。

表4 不同載藥納米載體對(duì)肺癌細(xì)胞克隆球形成的影響(%)

七、不同載藥納米載體對(duì)肺癌細(xì)胞生存的影響

雙靶向吉非替尼納米載體組肺癌A549細(xì)胞、A431細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的存活率均低于吉非替尼納米載體組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05(見表5)。

表5 不同載藥納米載體對(duì)肺癌細(xì)胞生存的影響(%)

討 論

腫瘤組織中存在較多的肺癌干細(xì)胞，參與肺癌的存活、肺癌癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及肺癌復(fù)發(fā)等過程，導(dǎo)致肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、放化療抵抗等事件的發(fā)生，且肺癌干細(xì)胞在上述過程中具有較為關(guān)鍵的作用，因此靶向肺癌干細(xì)胞可能會(huì)提高肺癌的藥物效果[8]。

CD133包括CD133-1、CD133-2兩個(gè)亞型，其中CD133-1在成人骨骼肌、胎兒腦組織中含量較高，但在胎兒腎臟、肝臟和成人胰腺等器官組織中未檢測(cè)到表達(dá)；CD133-2在多種成人組織、胎兒組織中含量較高[9-10]。CD133屬于一種5次跨膜糖蛋白，是傳統(tǒng)的造血干細(xì)胞、血液腫瘤和內(nèi)皮祖細(xì)胞包括肺癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物[11]。由于腫瘤細(xì)胞具有類干細(xì)胞的特點(diǎn)，對(duì)目前臨床上多種腫瘤的放療、化療治療均會(huì)出現(xiàn)不同程度上的敏感性，但大多數(shù)表現(xiàn)不敏感。在肺癌的治療過程中，存在小部分癌細(xì)胞可逃避抗癌藥物的作用，且可在短時(shí)間內(nèi)形成新的癌細(xì)胞，新生的癌細(xì)胞對(duì)先前的治療產(chǎn)生更強(qiáng)的耐受性[12]。CD133陽性腫瘤干細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性，且對(duì)放化療均不敏感[13]。與CD133陰性肺癌相比，CD133陽性肺癌細(xì)胞的干性基因表達(dá)，腫瘤克隆球成球能力和裸鼠成瘤能力均顯著提高，證實(shí)CD133陽性肺癌細(xì)胞有肺癌干細(xì)胞的特性。因此，CD133可作為有效靶點(diǎn)用于靶向肺癌干細(xì)胞。

EGFR參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，且和患者的預(yù)后有關(guān)。目前臨床上有研究表明，在肺癌組織中EGFR的表達(dá)顯著高于正常肺組織，此結(jié)果提示臨床上可利用EGFR在肺癌組織中的高表達(dá)特性來對(duì)肺癌細(xì)胞進(jìn)行靶向處理，以起到抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用[14-16]。因此我們?cè)O(shè)想：將EGFR核酸適體和我們前期構(gòu)建的CD133靶向納米載體相連，構(gòu)建成為雙重靶向并殺傷肺癌細(xì)胞與肺癌干細(xì)胞的靶向磷脂膠束納米載體，預(yù)期可以更好實(shí)現(xiàn)肺癌的治療。帶有配體(如適配體或抗體)的靶向納米粒子由于能提高其他藥物的靶向性而引起了廣泛的關(guān)注[17]。雖然反波在靶向納米粒子中有著廣泛的應(yīng)用，具有強(qiáng)的免疫原性等缺點(diǎn)。適配體是一種寡核苷酸，具有低免疫原性、低分子性等優(yōu)點(diǎn)。重量，容易生產(chǎn)，使他們成為理想的目標(biāo)配體[18]。該適配體A15已被證明是一種很有前途的配體，可靶向CD133細(xì)胞[19]。鑒于CD133是我們推測(cè)A15-CD133相互作用可以介導(dǎo)藥物有效地傳遞到CD133陽性的肺干細(xì)胞。核酸適體是經(jīng)體外篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)的寡聚核苷酸片段，有實(shí)驗(yàn)研究篩選出一種CD133靶向性核酸適體，可實(shí)現(xiàn)對(duì)CD133的高度特異性靶向[20]。

在本文研究中，從雙重靶向殺傷肺癌細(xì)胞與肺癌干細(xì)胞方向研究，在構(gòu)建的CD133靶向磷脂膠束納米載體基礎(chǔ)上，構(gòu)建成為遞送吉非替尼的雙重靶向并殺傷肺癌細(xì)胞與肺癌干細(xì)胞的靶向磷脂膠束納米載體，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌的靶向性治療。分析雙靶向納米載體的納米表征，檢測(cè)體內(nèi)外對(duì)肺癌細(xì)胞的靶向親和效力、雙重殺傷活性和抗腫瘤作用。本文研究顯示，制備雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體，結(jié)果顯示雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體可雙靶向殺傷肺癌細(xì)胞，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，但目前腫瘤干細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞雙重靶向的納米給藥系統(tǒng)應(yīng)用于肺癌治療，目前國內(nèi)外尚無研究報(bào)道，因此本文研究結(jié)果還需后續(xù)研究實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

綜上所述，雙靶向吉非替尼磷脂膠束納米載體可雙靶向殺傷肺癌細(xì)胞，具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。