孫衛(wèi)國 曹志紅 李改平 楊秉芬 劉艷華 賀雄 張靈霞

傳統(tǒng)的結核病診斷方法存在較大局限性，如抗酸染色敏感性低，而作為結核病診斷金標準的結核分枝桿菌培養(yǎng)則耗時較長，影響了結核病的早期診斷。結核病血清學診斷雖然具有快速特點，但所用的抗原仍然局限于38kD蛋白、16kD蛋白、ESAT-6、CFP-10等少數(shù)幾種，并且單獨用于結核病臨床診斷效果較差。另外，很大一部分人群處于結核分枝桿菌潛伏感染(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)狀態(tài)，臨床上目前還沒有成熟的LTBI診斷和檢測方法。結核病的防控需要開發(fā)新的診斷方法去鑒別并阻止?jié)摲腥净颊甙l(fā)展成活動性結核病(Tuberculosis，TB)[1]，目前以細胞免疫為基礎的結核分枝桿菌γ干擾素釋放試驗(interferon γ release array,IGRA)已經(jīng)獲得快速發(fā)展并進入臨床應用。這種檢測方法目前以T-SPOT，TB和QuantiFEron-TB Gold 試劑盒為代表，能區(qū)分結核分枝桿菌感染與BCG接種，適用于我國BCG廣泛接種的地方[2]。實驗室研究中有諸多 LTBI 相關蛋白結構和功能的報道，成為LTBI機制研究熱點，并有望應用于LTBI 的診斷。結核分枝桿菌Rv2660c和Rv2659c蛋白為BCG RD11區(qū)缺失抗原，是一類LTBI相關蛋白。體外低氧或營養(yǎng)缺乏環(huán)境下培養(yǎng)結核分枝桿菌，發(fā)現(xiàn)Rv2659c和Rv2660c這兩種蛋白基因的表達呈上調趨勢[3]；同時研究發(fā)現(xiàn)，在135株M.TB臨床分離株中，Rv2660c未發(fā)現(xiàn)突變，它的基因序列比較保守[4]。Rv2660c蛋白刺激結核分枝桿菌潛伏感染者外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)釋放IFN-γ水平明顯高于健康人群對照組[5]，這些都提示Rv2660c在潛伏感染狀態(tài)下機體免疫調節(jié)和保護潛伏感染過程中扮演著重要的角色。

鑒于Rv2660c蛋白在結核分枝桿菌中的作用和結構、功能特點，本課題采用成熟的原核表達系統(tǒng)獲得重組Rv2660c蛋白，以Western-Blot 實驗驗證該重組蛋白的抗原性，同時以ELISA 實驗評價其在血清學方面用于區(qū)分活動性結核病與潛伏感染是否具有診斷價值，本實驗為進一步研究該重組Rv2660c蛋白的干擾素-γ釋放試驗，分析其在潛伏感染實驗室診斷上的可行性 ；同時為研究 Rv2660c 在結核分枝桿菌內(nèi)的功能和結核分枝桿菌在饑餓狀態(tài)下免疫逃逸和潛伏感染等分子奠定基礎。

資料與方法

一、材料

1 研究對象 50例確診菌陽肺結核患者血清與50例菌陰肺結核患者血清由本室臨床實驗室鑒定收集提供，患者中男性60例，女性40例，年齡22～52歲，平均(35.6±15.2)歲，患者經(jīng)臨床表現(xiàn)、體征、胸部CT及實驗室診斷結果確診為肺結核，且無同時患有其它呼吸類疾?。痪柣颊邽榻Y核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，菌陰患者為結核分枝桿菌培養(yǎng)陰性；30例干擾素-γ 釋放試驗陽性的健康人(定義為潛伏感染者)血清本室收集保存，患者中男性15例，女性15例，年齡18～60歲，平均(33.2±16.3)歲；30例干擾素-γ 釋放試驗陰性的健康人血清由本院體檢中心提供，患者均為男性，年齡18～40歲，平均(23.2±14.6)歲。干擾素-γ 釋放試驗采用上海銘源數(shù)康生物芯片有限公司的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫斑點法)，具體操作見說明書。

2 質粒、菌株和血清 質粒pET-28a、E.coli DH5a、表達菌種BL21(DE3)系本室保存，其感受態(tài)細胞由本室制作。

3 儀器與試劑 Rv2660c蛋白全基因和引物由華大基因公司合成， NdeI(批號：0290201)與 XhoⅠ(批號：0581503)、T4 DNA連接酶(批號：0021012)購自NEB公司(美國)；PCR試劑來自天根生化生物公司(國產(chǎn))；酶標羊抗人IgG購自華美生物技術公司；親和樹脂填料購自美國GE公司，本室裝填純化柱、蛋白質相對分子質量marker (美國sigma公司)；其它試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

二、方法

1 Rv2660c 全基因與引物合成 通過NCBI查Rv2660c 的Gene ID: 887222，全基因共228個堿基.進行全序列合成，在5′ 和3′ 端分別引入NdeI(CATATG)和XhoⅠ( CTCGAG)酶切位點 ，在3′ 端加入原核表達系統(tǒng)偏愛終止密碼子TAA。合成全序列為：catatggtgatagcgg gcgtcgacca ggcgcttgca gcaacaggcc aggctagcca gcgggcggca ggcgcatctg gtggggtcac cgtcggtgtc ggcgtgggca cggaacagag gaacctttcg gtggttgcac cgagtcagtt cacatttagt tcacgcagcc cagattttgt ggatgaaacc gcaggtcaat cgtggtgcgc gatactggga ttgaaccagt ttcac taactcgag

合成的陽性克隆篩選鑒定引物為： 正向引物 5-ccccatatggtgatagcgg -3, 反向引物 5-ccgctcgagttagtgaaactgg-3

2 pET28a - Rv2660c 表達載體的構建 利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ對華大基因公司提供Rv2660全序列陽性克隆質粒pUC19- Rv2660c進行雙酶切獲得大小約230bp大小的核酸片段，然后與同樣雙酶處理的表達載體pET28a進行連接，連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌 BL21(DE3) 感受態(tài)細胞，菌落PCR篩選陽性克隆，獲得表達工程菌 pET28a - Rv2660c。

3 Rv2660c 融合蛋白的原核表達與純化 將陽性工程菌株轉接至含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)，監(jiān)控細菌生長A600 值，當OD值為0.5時加入IPTG至終濃度為0.3mmoL，37℃繼續(xù)誘導7h，離心收集菌體，在冰浴狀態(tài)下進行超聲破碎。4℃條件下高速離心后(12000rpm, 30分鐘)，取上清和沉淀進行 SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白的表達形式。重組蛋白N端攜帶6個組氨酸標簽，通過鎳離子螯合的親和層析柱對目的蛋白進行親和純化，分別以50mmoL咪唑除去菌體自身雜蛋白、150 mmoL咪唑洗脫收集重組，以15% SDS-PAGE鑒定純化后蛋白純度。

4 重組Rv2660c蛋白Western-Blot與ELISA實驗分析 將純化的重組Rv2660c蛋白干粉用PBS緩沖液配制成1mg/mL的母液備用，取 2μL加入載樣Buffer煮沸10min后行SDS-PAGE，半干法電轉到硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2小時，分別以確診菌陽結核病患者、菌陰結核患者、潛伏感染者和健康人對照血清37℃孵育2小時，PBST緩沖液洗滌后、以HRP標記的羊抗人IgG 37℃孵育1小時，漂洗干凈，過ECL暗室自動曝光顯影，分析該重組蛋白的抗原性。

以碳酸鈉鹽溶液將純化的重組Rv2660c蛋白進行稀釋，終濃度為6μg/mL，往96孔酶標板每孔加入100μL重組蛋白包被液，包被過夜，次日37℃條件下用5%的脫脂奶粉封閉2h，用PBS-Tween(0.05%)洗板5次，將菌陽結核病患者組、菌陰結核患者組、潛伏感染者組和健康人對照組血清用PBST按1 ∶20進行稀釋，每孔100μL分別加入包被孔和對照孔，于37℃孵育1h，重新洗板若干次，每孔再加入用 PBST按1 ∶1000 稀釋的HRP標記的羊抗人IgG 100μL，37℃震蕩孵育30min，再洗板5次，加TMB色底物，100μL/孔，室溫避光反應30min，每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4終止反應。酶標儀檢測450m波長處的A值,分析結果。

5 統(tǒng)計方法 用健康人的平均OD值加上2.576倍的其標準差(SD)作為cutoff( 即cutoff=meanhealthy+2.576×SD)來計算重組Rv2660c蛋白的檢出率和特異性[6]。

結 果

一、pET-28a-Rv2660c表達載體構建

將合成的 Rv2660c 核酸序列通過分子克隆技術插入到 pET-28a 表達載體上，采用菌落PCR的方法進行鑒定，1%的瓊脂糖核酸電泳顯示擴增片段大小在230bp左右，與預期值相符(圖1)。將陽性克隆送華大基因公司測序，測序結果證實構建成功。

圖1 Rv2660c核酸PCR鑒定凝膠電泳鑒定結果

M.marker DNA2000 1，3，5.重組Rv2660c陽性克隆；2，4.重組Rv2660c陽性克隆

二、重組Rv2660c融合蛋白表達與純化

重組Rv2660c工程菌經(jīng)IPTG誘導后可獲得目的蛋白的原核表達，經(jīng)過冰浴超聲破碎后，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，在目的分子量10.2KD處有明顯的蛋白表達，箭頭所示，其中超聲破碎上清和沉淀各占50%左右(圖2)。

圖2 重組Rv2660c蛋白表達SDS-PAGE分析

M.低分子量蛋白標準 1.無誘導對照 2.超聲后上清 3.超聲后沉淀

表達上清以親和層析純化后，150mmol咪唑洗脫液獲得的純化蛋白純度在85%左右(圖3)。

圖3 重組Rv2660c蛋白親和純化SDS-PAGE分析

M.低分子量蛋白標準 1.低濃度咪唑洗脫的雜蛋白； 2.親和純化的重組Rv2660c蛋白

三、重組Rv2660c蛋白Western Blot實驗結果

將菌陽結核病患者、菌陰結核病患者、潛伏感染者以及健康對照者的血清分別與重組蛋白進行印記實驗，實驗結果(見圖4)。活動性結核患者(包括菌陽患者和菌陰患者)的血清抗體能與獲得的重組蛋白發(fā)生抗原抗體反應，出現(xiàn)一條明顯的雜交條帶；而潛伏感染者和健康對照者的血清沒有出現(xiàn)雜交條帶。表明活動性結核患者體內(nèi)存在抗Rv2660c蛋白特異性抗體，潛伏感染者和健康對照者體內(nèi)不存在抗Rv2660c蛋白特異性抗體或抗體的滴度很低。

圖4 重組Rv2660c蛋白與各類血清Western Blot結果

四、重組Rv2660c蛋白ELISA試驗結果

以重組純化獲得的 Rv2660c 蛋白為包被抗原，應用 ELISA方法檢測各組人群血清中Rv2660c特異性抗體水平。結果(見表1)。

表1 ELISA檢測各組人群血清中 Rv2660c 特異性抗體結果組間比較

經(jīng)Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗，四組P分別等于0.714、0.407、0.660、0.848，認為所有四組數(shù)據(jù)均為近似正態(tài)分布。然后進行ANOVA檢驗，方差齊性檢驗，P值等于0.141，認為方差具有齊性。四組均數(shù)比較F=374.209，P=0.0，差異具有統(tǒng)計學意義。然后對組間均數(shù)進行兩兩比較，每兩組之間P值均<0.01，差異均有統(tǒng)計學意義。

重組蛋白與活動性結核病患者血清無論是菌陽性還是菌陰性均發(fā)生較強的免疫反應性，二者無顯著區(qū)別，P>0.05；它們的A450吸光值明顯高于潛伏感染組或健康對照組(P<0.05)；而潛伏感染組與健康組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

根據(jù)試劑盒說明書，設置cutoff為 meanhealthy+2.576×SD，重組蛋白檢測結核病人的陽性檢出率為61%，特異性為95.3%，檢測潛伏感染者血清的敏感性為21.6%，特異性為95.3%。結果證實重組Rv2660c蛋白對于活動性結核病的診斷具有較強的特異性，用于活動性結核病血清學診斷有一定價值，但相對于潛伏感染患者血清學診斷而言，不具有診斷作用。

討 論

尋找特異性血清學診斷抗原或者融合肽曾經(jīng)是結核病臨床診斷挖掘的方向，但目前敏感抗原還局限于38kD、ESAT-6、CFP-10等少數(shù)幾種，雖然它們的特異性都能滿足臨床需求，但敏感性較低，無法進行廣泛的應用。新型的干擾素-γ釋放試驗通過檢測結核分枝桿菌特異性抗原刺激T淋巴細胞產(chǎn)生的IFN-γ來判斷是否存在結核分枝桿菌感染，目前這種方法已經(jīng)用于結核病患者的臨床診斷，同時，這種干擾素-γ釋放試驗也開始用于LTBI的輔助診斷[7]，目前用于干擾素-γ釋放試驗結果較好的仍然是結核分枝桿菌RD1區(qū)編碼特異性抗原ESAT-6和CFP-10，它們可以區(qū)分BCG接種和結核分枝桿菌感染，與結核菌素試驗相比有更高的靈敏度和特異度[8]。結核病的臨床診斷需要新型結核分枝桿菌特異性抗原去提高診斷的敏感性，也需要新的特異蛋白鑒別活動性結核和潛伏感染。隨著研究的深入，一部分結核分枝桿菌潛伏感染相關蛋白結構、功能和潛伏感染相關性被逐漸認知，實驗室有望利用結核分枝桿菌潛伏感染相關抗原的功能作用建立起篩選結核分枝桿菌潛伏感染的診斷方法。Voskuil等[9]通過在體外缺氧的環(huán)境下培養(yǎng)結核分枝桿菌，檢測發(fā)現(xiàn)其中50個基因的表達上調，這些基因涉及到細菌細胞壁的合成、代謝和無氧呼吸等，它們被認為與結核分枝桿菌潛伏感染有關。

結核分枝桿菌Rv2660c也是一種潛伏感染相關蛋白，與結核分枝桿菌營養(yǎng)代謝有關，是饑餓刺激(Starvation stimulon)相關蛋白，環(huán)境營養(yǎng)缺乏時其表達上調，理論上可用于結核分枝桿菌潛伏感染的診斷研究。通過生物信息學研究發(fā)現(xiàn)，Rv2660c與人類蛋白的同源性僅為16%，和BCG菌體蛋白重復序列也較少，氨基酸序列保守，具有豐富的T細胞和B細胞抗原表位，抗原預測分值為0.9073，適合作為抗原進行疫苗研發(fā)或者診斷研究[10]。本實驗通過原核重組的方法獲得Rv2660c蛋白，分別將菌陽結核病患者、菌陰結核病患者、潛伏感染者以及健康對照者的血清分別與重組蛋白進行印記實驗，實驗結果表明活動性結核病患者(包括菌陽患者和菌陰患者)的血清抗體能與獲得的重組蛋白發(fā)生抗原抗體反應，出現(xiàn)一條明顯的雜交條帶；而潛伏感染者和健康對照者的血清沒有出現(xiàn)雜交條帶。說明活動性結核患者體內(nèi)存在抗Rv2660c蛋白特異性抗體，潛伏感染者和健康對照者體內(nèi)不存在抗Rv2660c蛋白特異性抗體或抗體的滴度很低。同時血清ELISA實驗表明菌陽結核病患者組、菌陰結核病患者組、潛伏感染組以及健康對照組A450平均值分別為0.52±0.21、0.48±0.16、0.28±0.14 和0.25±0.17。重組蛋白檢測結核病人血清的陽性檢出率為61%，特異性為95.3%；檢測潛伏感染者血清的陽性檢出率為21.6%，特異性為95.3%。實驗結果表明重組Rv2660c蛋白對于活動性結核的診斷具有較強的靈敏度和特異性，但對潛伏感染的診斷沒有價值。也說明單獨某一結核分枝桿菌重組抗原雖然具有良好的免疫反應性，但在血清學診斷應用上很難達到滿意的結果，同時，相對活動性結核病和潛伏感染狀態(tài)，通過血清學實驗進行區(qū)分也幾無可能。推測Rv2660c蛋白可能只在結核分枝桿菌活動或特定的環(huán)境下(比如結核分枝桿菌饑餓狀態(tài)下)通過上調表達抑制菌體某些代謝相關基因的功能，激發(fā)宿主提高體液免疫應答，而在潛伏感染穩(wěn)定的狀態(tài)下，結核分枝桿菌處于休眠不復制的平衡狀態(tài)，Rv2660c蛋白不再表達，而結核分枝桿菌休眠前Rv2660c蛋白在宿主體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體逐漸被稀釋或降解。機體免疫有記憶性，用重組Rv2660c蛋白刺激潛伏感染者的淋巴細胞，理論上會釋放干擾素-γ。實驗后期將以重組Rv2660c蛋白開展干擾素-γ釋放試驗，分析其在潛伏感染實驗室診斷上的可行性，同時進行結核分枝桿菌在饑餓狀態(tài)下免疫逃逸和潛伏感染相關機制研究。