劉 磊，盧冰霞，趙 碩，秦毅斌，段群棚，周英寧，蔣冬福，趙 武

（1.廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530007；3.廣西大學(xué)，廣西 南寧 530005）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種具有高度傳染性的豬腸道傳染病。其主要臨床特征為急性水樣腹瀉、嘔吐和脫水死亡；各年齡段豬均易感，但危害最嚴(yán)重的是1周齡內(nèi)的哺乳仔豬[1]。PEDV屬于甲型冠狀病毒屬的成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb[2]。1971年，在英國的豬群中PED首次被發(fā)現(xiàn)[3]，至今在全球主要養(yǎng)豬地區(qū)如歐洲、亞洲、北美洲等仍存在該病的影響。2010年以來，由PEDV變異毒株引起的，以高發(fā)病率和高死亡率為臨床特征的哺乳仔豬腹瀉（病死率達80%～100%）在中國豬群中大范圍暴發(fā)流行，造成了數(shù)百萬的哺乳仔豬死亡和巨大的經(jīng)濟損失[4-5]。

豬鏈球菌病主要是由C、D、F、L、S、R等群鏈球菌引起一種人獸共患的傳染病，屬國家規(guī)定二類動物疫病[6]。1998—1999年江蘇暴發(fā)了發(fā)病率及死亡率高達50%左右的由R群2型豬鏈球菌（S.s2）感染引起的豬鏈球菌病，導(dǎo)致數(shù)萬頭生豬死亡，損失慘重[7]。豬鏈球菌病多呈地方性暴發(fā)，易感豬群發(fā)病率及死亡率均較高，感染后可導(dǎo)致豬發(fā)生腦膜炎、流產(chǎn)、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、支氣管肺炎等疾病，并可經(jīng)發(fā)病豬感染人導(dǎo)致人的急性腦膜炎、感染性中毒休克綜合征和死亡等，嚴(yán)重危及人類健康和生命安全以及養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，是重要的公共衛(wèi)生問題[8]。

2018年10月28日到2019年1月中旬，廣西一存欄1 000頭母豬場2～3日齡仔豬出現(xiàn)吐奶、水樣腹瀉、脫水等癥狀，發(fā)病率達80%，病死率可高達100%。1月25日豬場將其中2窩拉稀仔豬送往廣西獸醫(yī)研究所病毒研究室進行檢測，剖檢發(fā)現(xiàn)所有拉稀仔豬腸道腸壁變薄并充滿黃色液體，腸系膜淋巴結(jié)腫大出血，腦充血。實驗室檢測結(jié)果表明PEDV和S.s混合感染可能是引起本次仔豬拉稀的主要原因?，F(xiàn)將該病例的檢測報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料

拉稀仔豬2窩，每窩6頭，共12頭，由廣西某豬場送往本實驗室進行病原檢測。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品；2xF8 Fastlong PCR MasterMix為北京艾德萊生物科技公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）為北京陸橋公司產(chǎn)品；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；DL 2 000 DNA Marker為Takala公司產(chǎn)品。

1.3 引物

由生工生物工程（上海）股份有限公司合成PEDV和S.s等檢測引物，PCR擴增核苷酸片段大小預(yù)期為492 bp和294 bp。引物序列：PEDV-P1：5'-TTTTCACTTAGAGAACGGACTTG-3'、PEDV-P2：5'-AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG-3'；S.s-P1：5'-CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT-3'、S.s-P2：5'-GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA-3'。

2 實驗室診斷

2.1 剖檢變化

對病死拉稀仔豬剖檢可見，腦充血、腸道腸壁擴張變薄內(nèi)有黃色黏稠液體，腸系膜充血、出血，包括腸系膜淋巴結(jié)在內(nèi)的多處淋巴結(jié)腫大出血（圖1），脾臟稍腫大。其它實質(zhì)器官無明顯眼觀病理變化。

2.2 細菌分離及藥敏試驗

每窩仔豬隨機選取2頭用無菌接種環(huán)從拉稀仔豬腦、腎臟、脾臟、肺臟和腸系膜淋巴結(jié)取樣無菌接種到TSA鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上，放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察細菌生長情況。用接種環(huán)挑取菌落進行涂片，革蘭氏染色，在顯微鏡油鏡下觀察細菌形態(tài)。采用K-B涂布法測定分離菌株對常見藥物的敏感性。

2.3 病毒檢測

2.3.1 病料處理 每窩拉稀仔豬（3頭）混為一份進行處理，無菌條件下采取拉稀仔豬的腦、肝臟、肺臟和脾臟等部位按照1∶3比例添加滅菌的PBS溶液，用勻漿器進行研磨；拉稀仔豬糞便或腸道及其內(nèi)容物，按照1∶10比例添加滅菌的PBS溶液，用勻漿器進行研磨；制得的懸液反復(fù)凍融3次；12 000 r/min離心5 min，取上清液用于下一步樣品病原DNA/RNA的提取。

2.3.2 樣品病原DNA/RNA的提取 處理好的組織病料和TSA鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物按照AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用說明書進行樣品病原DNA/RNA提取。所獲得的DNA用于下一步的PCR反應(yīng)或置于-80℃保存，備用；所獲得的RNA用于下一步的RT-PCR，或置于-80℃保存，備用。

2.3.3 樣品病原PCR/RT-PCR檢測 參考秦毅斌等[9]方法對常見腸道腹瀉病毒—PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PRoV）和豬丁型冠狀病毒（PDCoV）進行RT-PCR檢測。同時參考劉磊等[10]檢測方法對可能引起仔豬腹瀉的常見病毒如豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）進行PCR/RT-PCR檢測。RT反應(yīng)體系按照HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒進行，總體積為20μL：5×RT Buffer 4μL，dNTPMix 4μL，Primer Mix 2μL，DTT 2μL，HiFiScript 1μL，RNA Template 7.0μL。cDNA合成反應(yīng)條件：42℃，40 min，反應(yīng)產(chǎn)物即用或-20℃保存?zhèn)溆?。采?5μL PCR反應(yīng)體系：2 x F8 Fastlong PCR MasterMix 12.5 μL，25μmol/L上、下游引物各0.5μL，滅菌水8.5 μL，模板3.0μL。反應(yīng)程序為：94℃3min，94℃10 s，退火溫度10 s，72℃10 s，30個循環(huán)；72℃10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 細菌分離培養(yǎng)、鏡檢和藥敏試驗結(jié)果

從4頭拉稀仔豬的腦和腸系膜淋巴結(jié)中分離培養(yǎng)出圓形隆起、灰白色、濕潤透明菌落，菌落周圍形成β型溶血環(huán)。挑取單個菌落涂片鏡檢，結(jié)果均呈革蘭氏染色陽性，菌體呈球形或橢圓形，并多呈短鏈狀或成對或單個排列（圖2）。藥敏試驗結(jié)果顯示：分離培養(yǎng)出的菌株對氧氟沙星、頭孢噻呋鈉、阿米卡星等藥物敏感，對青霉素、阿莫西林、鏈霉素、克拉霉素、卡那霉素等藥物耐藥。

3.2 組織樣品和細菌培養(yǎng)物PCR/RT-PCR檢測結(jié)果

混合的4份組織樣品PCR/RT-PCR檢測結(jié)果顯示，送檢的2窩腹瀉仔豬TGEV、PRoV、PDCoV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PCV3均為陰性，而PEDV均為陽性，結(jié)果見圖3和圖4。細菌培養(yǎng)物PCR檢測結(jié)果顯示，送檢的2窩腹瀉仔豬4份分離培養(yǎng)出的細菌均為S.s陽性，結(jié)果見圖5。將其中1份PEDV和S.s陽性PCR產(chǎn)物送生工生物（上海）工程有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI里進行Blast，結(jié)果顯示PEDV陽性PCR產(chǎn)物測序所得的核苷酸序列與NCBI上登錄的2010年以后我國其它PEDV同源性在97.8%～99.7%之間，證明擴增的目的片段是PEDV基因片段，S.s陽性PCR產(chǎn)物測序所得的核苷酸序列與NCBI上登錄的S.s2同源性在99.2%～100%之間，證明擴增的是S.s2基因片段。因此從基因水平上進一步證實混合感染PEDV和S.s2是導(dǎo)致該豬場仔豬拉稀的主要原因。

4 防控措施

4.1 加強發(fā)病豬舍的飼養(yǎng)管理水平，對豬舍、環(huán)境、用具和運輸工具等均要進行徹底清掃消毒。發(fā)病豬舍一天消毒2次，使用百菌消1∶300稀釋或者過氧乙酸1∶500稀釋帶豬消毒，其它豬舍每天消毒1次。對病死豬及其糞污進行無害化處理。

4.2 用基于PEDV變異株的豬流行性腹瀉/豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗對所有母豬進行緊急接種，并對產(chǎn)前7 d母豬進行加強免疫。同時使用豬鏈球菌多價滅活菌苗對豬群進行免疫。在母豬群飼料中添加黃芪多糖粉400 g/t，連用7 d；豬群飲水中添加500 g/t，連用7 d；母豬群使用長效頭孢10mL/頭，仔豬三針保健使用頭孢噻呋鈉粉針，使用劑量按照0.01mg/kg。對新生仔豬加強保溫等飼養(yǎng)管理措施。

經(jīng)過采取上述防控措施，豬場仔豬拉稀疫情得以有效控制，沒有出現(xiàn)新病例。

5 小結(jié)與分析

2018年10月28日到2019年1月中旬，廣西一存欄1 000頭母豬場，2～3日齡仔豬出現(xiàn)吐奶、水樣腹瀉、脫水等癥狀，發(fā)病率達80%，病死率可高達100%。為確診引起該規(guī)模豬場新生仔豬拉稀死亡的病因，1月25日該豬場將其中2窩拉稀仔豬送往本實驗室進行綜合病原檢測。實驗室檢測結(jié)果表明：送檢的2窩拉稀仔豬PEDV和S.s2均為陽性。結(jié)合豬場的發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢病變以及實驗室檢測結(jié)果最終確診PEDV和S.s2混合感染是引起本次仔豬拉稀的主要原因。

在養(yǎng)豬生產(chǎn)中能夠引起仔豬拉稀的原因有很多，營養(yǎng)原因、應(yīng)激原因以及疫病原因等均可能造成新生仔豬的拉稀和死亡。而在疫病方面，PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV2等病原的感染均可能引起新生仔豬拉稀和死亡，而且在臨床癥狀上難以區(qū)別，因此發(fā)生疫情時，需要快速進行病原學(xué)鑒別診斷，以確定引起發(fā)病的原因，盡快制定及采取有效防控的針對性措施，平息疫情，減少損失。

由豬鏈球菌引起的豬腦膜炎性、敗血型鏈球菌病會引起病豬全身淋巴結(jié)腫大出血，破壞動物機體的免疫系統(tǒng)，豬腦膜炎型鏈球菌病的病豬腦膜充血還會造成豬嗜睡、昏迷等神經(jīng)功能障礙。該豬場送檢的拉稀仔豬中除了檢測出PEDV外，還均檢測出S.s2感染，S.s2感染可能破壞了仔豬的免疫系統(tǒng)、加重了PED疫情并且降低了PED疫苗免疫效果，這可能是哺乳仔豬長時間腹瀉并造成大量死亡的主要原因。

S.s2對很多藥物具有耐藥性，因此通過藥敏試驗篩選敏感藥物是控制疫情的關(guān)鍵措施，藥敏試驗的結(jié)果顯示所分離的鏈球菌對青霉素、阿莫西林等藥物耐藥，僅對氧氟沙星、阿米卡星、頭孢噻呋鈉敏感。