陶 璇，顧以韌，楊雪梅，梁 艷，何志平，鐘志君，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，王 言，龔建軍，應(yīng)三成，呂學(xué)斌

（四川省畜牧科學(xué)研究院動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066）

miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA的3′UTR，降解靶miRNA或阻止蛋白質(zhì)翻譯，在轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)，是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、代謝、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程中起著重要作用[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs與豬脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖密切相關(guān)[2]。其中，miR-206主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡以及細(xì)胞遷移等的調(diào)控，是肌肉特異表達(dá)的miR-1家族成員之一，早期的研究表明，miR-206參與肌肉的生成[3]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)miR-206與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為一種腫瘤抑制基因[4]；但miR-206與脂肪細(xì)胞的分化、增殖相關(guān)的研究還未見報(bào)道。

鑒于此，本試驗(yàn)以四川省6個(gè)地方豬種丫杈豬、內(nèi)江豬、成華豬、青峪豬、雅南豬、藏豬為研究對(duì)象，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-206在不同豬種背部皮下脂肪中的表達(dá)差異情況，為進(jìn)一步探明不同豬種脂肪沉積能力及肉質(zhì)差異形成的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年4—10月在四川省畜牧科學(xué)研究院種豬科研基地進(jìn)行。6個(gè)四川省地方豬種包括丫杈豬、內(nèi)江豬、青峪豬、雅南豬、成華豬、藏豬，每個(gè)豬種隨機(jī)選取3頭健康斷奶仔豬（30日齡），共計(jì)18頭，同一時(shí)間開始組建群體，相同品種同欄飼養(yǎng)，采用相同營(yíng)養(yǎng)水平和飼喂方式，達(dá)到6月齡進(jìn)行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數(shù)3～4肋骨間對(duì)應(yīng)處的背部皮下脂肪組織。

1.2總RNA提取和QRT-PCR

脂肪組織的RNA按照miRNeasy Mini Kit(Qiagen,China)的操作說(shuō)明書提取，QRT-PCR采用miScriptⅡRT Kit（Qiagen，China）根據(jù)操作說(shuō)明將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用miScript SYBR?Green PCR Kit（Qiagen，China）在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）儀器上進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)體系20μL。以5S、18S和U6作為熒光定量PCR的內(nèi)參基因，引物信息見表1。所有目的mRNA定量結(jié)果均通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性，確保產(chǎn)物無(wú)引物二聚體，每個(gè)樣本重復(fù)3次，每次檢測(cè)含3個(gè)陰性對(duì)照。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用GeNorm軟件計(jì)算看家基因的歸一化因子NF（Normalization factor）值，以目的基因的拷貝數(shù)與對(duì)應(yīng)樣本的NF值的比值表示基因的相對(duì)表達(dá)量。采用SigmaPlot 12.5軟件對(duì)性狀指標(biāo)和基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（ANOVA），結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

由表2可知，藏豬miR-206相對(duì)表達(dá)量最高，成華豬次之，青峪豬最低；藏豬miR-206相對(duì)表達(dá)量顯著高于內(nèi)江豬（P＜0.05），極顯著高于丫杈豬和青峪豬（P＜0.01）。

表2 不同豬種背部皮下脂肪miR-206相對(duì)表達(dá)量

3 討論

脂肪組織不僅是動(dòng)物機(jī)體能量?jī)?chǔ)存的一種形式，還參與調(diào)節(jié)包括食欲和能量消耗等多個(gè)機(jī)體功能，對(duì)繁殖、炎癥和免疫反應(yīng)等多個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程也有重要調(diào)控作用[5]。此外，脂肪還是影響豬經(jīng)濟(jì)價(jià)值和肉質(zhì)風(fēng)味的重要因素[6-7]。因此，研究豬的脂肪代謝不僅有利于改善胴體和肉質(zhì)性能，還有助于推動(dòng)人類肥胖和代謝性疾病的研究。

為探明豬脂肪沉積性狀相關(guān)基因或調(diào)控因子差異表達(dá)的分子遺傳機(jī)理，近年來(lái)育種學(xué)家已在豬脂肪沉積的調(diào)控機(jī)理方面做了大量研究[8-9]，但這些研究主要集中在DNA和mRNA水平的編碼基因，隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究的深入，從轉(zhuǎn)錄后的miRNA水平探索豬脂肪沉積形成的分子機(jī)理成為了研究的熱點(diǎn)[2]，但相關(guān)報(bào)道仍然較少。研究發(fā)現(xiàn)，miR-193b、miR-365、miR-196a、miR-133a/b、miR-455在棕色脂肪形成中有重要作用[10-11]，miR-128也可通過(guò)靶向基因抑制前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化[12-14]。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-206在1日齡榮昌豬背部皮下脂肪組織中高表達(dá)，之后30、90、240日齡表達(dá)水平急劇下降。

本試驗(yàn)對(duì)四川省6個(gè)地方豬種背部皮下脂肪中miR-206的表達(dá)差異情況進(jìn)行了研究，研究結(jié)果可為進(jìn)一步探明miRNA在豬脂肪沉積中的作用提供參考。