趙曄，于磊，王秀穎，董麗娜

糖尿病腎病(DN)是臨床較為常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，主要以彌漫性腎小球硬化、大量蛋白尿及尿清蛋白排泄率(UAER)水平升高為臨床表現(xiàn)[1]。而隨著DN病情的不斷發(fā)展，尿蛋白排泄及腎小球破壞逐漸加重，最終造成腎間質(zhì)、腎小管及腎小球纖維化，是導(dǎo)致終末期腎病的重要影響因素[2]。范廷廷等[3]研究顯示，在DN發(fā)病時(shí)，機(jī)體足細(xì)胞顯著減少，且程度與蛋白尿量呈正相關(guān)，足細(xì)胞數(shù)量降低，加速了終末期腎衰竭患者的衰竭速度。研究顯示，威廉姆斯腫瘤蛋白-1(WT-1)是一種主要在細(xì)胞核上表達(dá)的足細(xì)胞核蛋白；synaptopodin是主要在足細(xì)胞細(xì)胞膜上表達(dá)的特異性骨架蛋白，其表達(dá)情況可以間接反映腎組織足細(xì)胞損傷的程度[4]。另外足細(xì)胞裂孔膜蛋白(Nephrin)是一種跨膜蛋白，存在于足細(xì)胞裂孔隔膜上，在腎小球?yàn)V過(guò)功能中起著重要的作用；而足細(xì)胞標(biāo)志蛋白(PCX)是足細(xì)胞損傷的標(biāo)志性物質(zhì)，正常情況下2種物質(zhì)不在尿液中出現(xiàn)[5]。多項(xiàng)研究顯示，腎臟對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)較為敏感，在DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用顯著[6]。并發(fā)DN時(shí)，機(jī)體會(huì)生成更多的血清活性氧(ROS)，從而對(duì)足細(xì)胞的凋亡起到介導(dǎo)作用，造成PCX的脫落。Hu等[7]認(rèn)為氧化應(yīng)激狀態(tài)對(duì)Nephrin的表達(dá)產(chǎn)生一定程度的影響，造成尿蛋白排泄、足細(xì)胞脫落及腎損傷的加重。故本研究分析維生素D3治療的DN患者腎組織足細(xì)胞損傷與ROS、晚期蛋白氧化產(chǎn)物(AOPP)及超氧化物歧化酶(SOD)的相關(guān)性，為其臨床診治提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月—2019年1月內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)科診治DN患者86例作為研究對(duì)象，根據(jù)患者UAER分為大量組(UAER≥200 μg/min，n=46)和微量組(20 μg/min≤UAER<200 μg/min，n=40)2組。2組患者在性別、年齡、糖尿病病史、BMI、血壓、血糖及合并癥等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)診斷標(biāo)準(zhǔn)： ①患者空腹血糖(8 h內(nèi)未進(jìn)任何食物，飲水除外)>7.0 mmol/L；②伴有典型的高血糖及高血糖危象癥狀者，隨機(jī)血糖>11.0 mmol/L；③2 h糖耐量試驗(yàn)血糖>11.0 mmol/L；④糖化血紅蛋白含量>6.5%者；⑤可伴有不同程度的腎功能不全；⑥排除其他相關(guān)原因引起的持續(xù)性及間歇性臨床蛋白尿；⑦伴有視網(wǎng)膜病變者；⑧腎活檢確診[8]。(2)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合上述DN診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②臨床資料完整者。(3)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急性、慢性炎性反應(yīng)者；②妊娠、哺乳期患者；③合并其他繼發(fā)性或原發(fā)性腎病者；④合并嚴(yán)重精神疾病、心腦血管疾病及肝臟疾病者；⑤對(duì)維生素D3過(guò)敏者；⑥6個(gè)月內(nèi)應(yīng)用抗氧化劑、血管緊張素受體拮抗劑等藥物者；⑦依從性差，中途退出者。

1.3 治療方法 所有患者均給予高血壓和糖尿病飲食教育，治療期間使用胰島素維持血糖在正常水平。對(duì)于高血壓患者給予適量的ARB或ACEI類藥物控制血壓?；颊哂?周洗脫期后，以骨化三醇(青島正大海爾制藥有限公司生產(chǎn))0.25 μg/d口服，治療3個(gè)月。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 血清ROS、AOPP及SOD水平測(cè)定：于治療前后清晨空腹抽取患者肘靜脈血2 ml，離心取上清，采用比色法測(cè)定血清ROS、AOPP及SOD水平。

1.4.2 尿PCX、Nephrin水平測(cè)定：收集患者治療前、治療3個(gè)月后晨尿10 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定PCX、Nephrin，試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，操作方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書執(zhí)行。

表1 2組患者基線資料比較

1.4.3 腎臟組織內(nèi)synaptopodin和WT-1表達(dá)測(cè)定：采用10%甲醛對(duì)腎臟穿刺活檢腎組織進(jìn)行固定，石蠟切片，抗原采用95℃微波修復(fù)10 min。以小牛血清在室溫下封閉20 min;再向其中加入小鼠抗人synaptopodin單克隆抗體(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，在4℃條件下孵育12 h;采用磷酸鹽緩沖液洗片5 min/次，共3次。兔抗小鼠IgG經(jīng)異硫氰酸熒光素[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]進(jìn)行標(biāo)記，在室溫條件下孵育20 min;采用磷酸鹽緩沖液洗片5 min/次，共3次;再向其中加入兔抗人WT-1多克隆抗體(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司)，在4℃條件下孵育12 h;采用磷酸鹽緩沖液洗片5 min/次，共3次。羊抗兔IgG采用羅丹明[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]標(biāo)記，在室溫條件下孵育20 min。采用磷酸鹽緩沖液洗片5 min/次，共3次，封片。采用激光共聚焦熒光顯微鏡(EVOS型, 賽默飛世爾公司)雙熒光集成圖像對(duì)synaptopodin和WT-1染色分布情況進(jìn)行觀察,并采用Imagerpro5.0圖像分析軟件對(duì)synaptopodin和WT-1陽(yáng)性百分比進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清ROS、AOPP及SOD水平變化 與治療前比較，治療3個(gè)月后2組患者血清ROS、AOPP水平均明顯降低，血清SOD明顯升高；與大量組比較，治療后微量組上述指標(biāo)變化更為顯著(P<0.01)，見表2。

2.2 2組尿PCX及Nephrin水平變化 與治療前比較，治療3個(gè)月后2組患者尿PCX及Nephrin水平均明顯降低；與大量組比較，治療后微量組患者上述指標(biāo)降低更為顯著(P<0.01)，見表3。

2.3 2組腎臟組織內(nèi)synaptopodin和WT-1表達(dá)水平比較 與治療前比較，治療3個(gè)月后2組患者腎臟組織內(nèi)synaptopodin和WT-1表達(dá)水平均明顯降低；與大量組比較，治療后微量組患者上述指標(biāo)降低更為顯著(P<0.01)，見表4。

2.4 尿PCX、Nephrin與血清ROS、AOPP、SOD水平相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，患者尿PCX、Nephrin水平與血清ROS、AOPP呈正相關(guān)，與血清SOD呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表5。

表3 2組患者治療前后尿PCX及Nephrin水平變化

表4 2組患者治療前后腎臟組織內(nèi)synaptopodin和WT-1表達(dá)水平比較

表5 尿PCX、Nephrin水平與血清ROS、AOPP及SOD水平的相關(guān)性分析

表2 2組患者治療前后血清ROS、AOPP、SOD水平變化

2.5 腎臟組織內(nèi)synaptopodin和WT-1與血清ROS、AOPP、SOD水平相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，患者synaptopodin和WT-1表達(dá)水平與血清ROS、AOPP呈正相關(guān)，與血清SOD呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表6。

表6 synaptopodin和WT-1表達(dá)水平與血清ROS、AOPP及SOD水平的相關(guān)性分析

3 討 論

足細(xì)胞是一種終末分化的，位于腎小球臟層的上皮細(xì)胞，呈現(xiàn)多突狀，是腎小球?yàn)V膜的重要組成部分，經(jīng)分化成熟后，一般不可再生[9]。DN患者在早期發(fā)生足細(xì)胞損傷時(shí)，主要以足突融合、細(xì)胞變性肥大、足細(xì)胞密度和數(shù)量的減少為主要臨床表現(xiàn)[10]。另外，足細(xì)胞損傷還會(huì)造成機(jī)體產(chǎn)生大量的蛋白尿，Nephrin是一種在足細(xì)胞裂孔膜上特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，在腎小球機(jī)械和電荷屏障功能中發(fā)揮重要的作用，其異常表達(dá)可以一定程度反映腎臟足細(xì)胞損傷情況[11]。Zhang等[12]研究顯示，早期DN患者出現(xiàn)Nephrin表達(dá)量代償性增加，從而引起其膜上的骨架蛋白發(fā)生重新分布，進(jìn)而引起骨架上的Nephrin蛋白逐漸脫離出來(lái)，隨尿液逐漸向體外排出；另外，此時(shí)患者的腎小球屏障也遭到一定程度的破壞，形成蛋白尿。PCX是一種表達(dá)于足細(xì)胞的唾液酸黏蛋白分子，并存在于細(xì)胞頂膜位置，帶負(fù)電，參與腎小球分子屏障和電荷屏障的形成[13]。Fan等[14]認(rèn)為對(duì)于足細(xì)胞損傷，PCX蛋白表達(dá)情況可作為一種標(biāo)志物。骨化三醇除具有鈣磷代謝調(diào)節(jié)作用外，還可對(duì)RAS系統(tǒng)、活化免疫細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉淀起到抑制作用，改善機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)，從而起到保護(hù)腎臟的作用[15]。本研究顯示，對(duì)于大量和微量蛋白尿患者，骨化三醇均可減少尿PCX、Nephrin 及synaptopodin、WT-1的生成，改善機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)。Zhu等[16]研究認(rèn)為，高糖環(huán)境下對(duì)腎小球足細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可增加Col-Ⅳ蛋白、纖維連接蛋白的分泌，加入維生素D3后會(huì)緩解上述癥狀，改善足細(xì)胞損傷。Yang等[17]研究認(rèn)為維生素D3可以抑制腎素形成、下調(diào)RAS，從而對(duì)系膜細(xì)胞增殖情況產(chǎn)生抑制效果，進(jìn)而改善足細(xì)胞損傷。

綜上所述，維生素D3可以一定程度改善DN患者足細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激狀態(tài)，且DN患者足細(xì)胞損傷與血清ROS、AOPP水平呈正相關(guān)，與血清SOD水平呈負(fù)相關(guān)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

趙曄：整理資料，分析資料，撰寫論文；于磊：修改總指導(dǎo)；王秀穎：收集整理資料，分析數(shù)據(jù)，圖表設(shè)計(jì)；董麗娜：查找參考書籍，收集資料