賈燕花

(國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，北京 100022)

血液制品是由人類血液或血漿制備成的治療產(chǎn)品，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版收載品種有人血白蛋白、人免疫球蛋白等[1]。其中靜注人免疫球蛋白(IVIG)制品是從1000名以上供血漿者的血漿混合物制備而成，具有免疫替代和調(diào)節(jié)的雙重作用，目前被廣泛用于感染性疾病和自身免疫性疾病的治療[2]。

IVIG制品的臨床療效與其生物學(xué)功能密不可分，第1代和第2代IVIG生產(chǎn)方法均會(huì)損害人免疫球蛋白的Fc片段，進(jìn)而影響其生物學(xué)功能[3]、制品的存放會(huì)導(dǎo)致人IgGFc段生物活性降低和退化，且實(shí)際生產(chǎn)工藝中有多種因素會(huì)影響Fc段生物學(xué)活性，因此需要對(duì)人免疫球蛋白進(jìn)行Fc段的生物學(xué)活性檢測(cè)?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版三部也規(guī)定Fc 段生物學(xué)活性檢測(cè)方法[1]，且《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版引入供試品激活補(bǔ)體的功能指數(shù)應(yīng)不低于國(guó)家參考品活性的60%的要求。

目前報(bào)道有多種人免疫球蛋白Fc段生物學(xué)活性檢測(cè)方法，如激活補(bǔ)體試驗(yàn)、結(jié)合Fc 受體的調(diào)理活性試驗(yàn)、巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌作用試驗(yàn)、紅細(xì)胞玫瑰花形成抑制試驗(yàn)、靜注人免疫球蛋白與葡萄球菌A 蛋白結(jié)合試驗(yàn)、靜注人免疫球蛋白與Fc 特異單抗結(jié)合試驗(yàn)及單向散射擴(kuò)散溶血試驗(yàn)等[4]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版和《歐洲藥典》[5]均采用激活補(bǔ)體檢測(cè)方法，該方法具有干擾因素較少、操作較簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果較準(zhǔn)確等特點(diǎn)，但也受一些因素的影響，如檢測(cè)原理中采用單點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品、供試品中抗體滴度、IgG亞型、抗原的種類及效價(jià)、補(bǔ)體的反應(yīng)條件(補(bǔ)體效價(jià)、反應(yīng)溫度、抗原的致敏效價(jià)等)等[6]。筆者主要闡述激活補(bǔ)體檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，就抗原、敏化紅細(xì)胞、補(bǔ)體效價(jià)、檢測(cè)方式等進(jìn)行綜述，為IVIG制品的質(zhì)量控制提供參考。

1 人免疫球蛋白Fc生物學(xué)活性檢測(cè)方法的比較

《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版和《歐洲藥典》均收載Fc段生物學(xué)活性檢測(cè)方法，檢測(cè)方法的原理相同，檢測(cè)步驟和溶血反應(yīng)檢測(cè)方法存在差異。

1.1抗原方面 《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版僅在敏化紅細(xì)胞方法中表述了用磷酸鹽緩沖液(PBS)適當(dāng)稀釋的白喉類毒素或腮腺炎病毒，無滴度要求，《歐洲藥典》中規(guī)定風(fēng)疹抗原的滴度>256HA units。

1.2敏化紅細(xì)胞制備方面 在紅細(xì)胞來源、紅細(xì)胞懸液制備方法等方面均有差異。①《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定人抗凝O型血要求3人份以上混合，而未規(guī)定貯存條件，《歐洲藥典》中存儲(chǔ)條件要求為在4 ℃條件下≤3周。②紅細(xì)胞懸液制備方法，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定分離紅細(xì)胞，取適量壓積紅細(xì)胞懸浮于1.3 mg·L-1鞣酸PBS(1：40)，37 ℃水浴輕搖30 min，洗滌后用PBS制備成2.5%紅細(xì)胞懸液；《歐洲藥典》規(guī)定分離后紅細(xì)胞以2%(V/V)懸浮于PBS(pH值7.2)中，將1體積的鞣酸溶液與1體積的人紅細(xì)胞懸液混合，37 ℃孵育10 min，洗滌后用PBS制備成1%紅細(xì)胞懸液。③敏化抗原的制備，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定紅細(xì)胞懸液與抗原溶液混合比例為1：4，混合后置于37 ℃水浴中輕搖30 min；《歐洲藥典》規(guī)定每毫升鞣酸化紅細(xì)胞添加風(fēng)疹抗原0.2 mL，置于37 ℃水浴孵育30 min，同時(shí)規(guī)定初始測(cè)定吸光度混合，按照敏化紅細(xì)胞懸液100 μL和白蛋白-巴比妥緩沖液900 μL混合測(cè)定。

1.3補(bǔ)體方面 《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版僅在測(cè)定法中體現(xiàn)補(bǔ)體用量，每毫升含補(bǔ)體150 CH50，未提供補(bǔ)體的制備方法和貯存條件?！稓W洲藥典》規(guī)定豚鼠補(bǔ)體從不低于10只豚鼠的血液制備，提供制備方法和貯存條件，用量為每毫升含補(bǔ)體125～200 CH50。

1.4供試品和參考品制備方法 兩者在供試品制備，濃度規(guī)定方面有差異，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定將供試品pH值調(diào)節(jié)至6.8～7.0，再用牛白蛋白-巴比妥緩沖液將供試品IgG濃度稀釋至每毫升含40 mg；《歐洲藥典》中規(guī)定，將供試品用白蛋白-巴比妥緩沖液稀釋獲得免疫球蛋白30～40 mg，并用白蛋白-巴比妥緩沖液獲得最終體積為900 μL的溶液。參考品的制備方法均同供試品。

1.5檢測(cè)方式 《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版采用紫外-可見分光光度法檢測(cè)，《歐洲藥典》中同時(shí)收載紫外-可見分光光度法和微孔板光度法兩種溶血反應(yīng)檢測(cè)方法。檢測(cè)方法中，供試品和敏化紅細(xì)胞混懸液混合后的處置條件不一致，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定置37 ℃水浴中輕搖30 min，《歐洲藥典》規(guī)定為靜置15 min。

2 Fc段生物學(xué)活性測(cè)定法的優(yōu)化

2.1抗原的種類和效價(jià)激活 補(bǔ)體是通過抗體的Fab段與相應(yīng)的抗原結(jié)合后，IgG暴露出Fc結(jié)合C1q的補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)，啟動(dòng)補(bǔ)體激活系統(tǒng)，從而能有效的和快速的殺死病原菌。人免疫球蛋白Fc段生物學(xué)活性測(cè)定法是通過與紅細(xì)胞上已包被的相應(yīng)抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體后最終導(dǎo)致紅細(xì)胞的細(xì)胞膜受到攻擊、破裂，從而釋放出血紅蛋白，由溶血反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線來測(cè)定。關(guān)于紅細(xì)胞上的包被抗原，《歐洲藥典》相應(yīng)方法中推薦采用風(fēng)疹病毒抗原，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版的相應(yīng)方法中推薦采用白喉類毒素或腮腺炎病毒，且《歐洲藥典》和《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版方法中均僅考察一種抗原特異抗體的Fc段生物學(xué)活性。

席亮等[7]分別考察白喉類毒素、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒、乙型肝炎表面抗原、破傷風(fēng)類毒素和腦膜炎球菌P64k蛋白等6種抗原對(duì)Fc段生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果的影響，重復(fù)性比較穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果依次為129%，132%，117%，98%，82%和118%，均高于80%，同一批次樣品Fc段生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果差別較大，推測(cè)是由于供試品中不同抗原抗體滴度不同造成的?！稓W洲藥典》和《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版采用不同的抗原，表明Fc段生物學(xué)活性檢測(cè)抗原的選擇應(yīng)該考慮供試品中針對(duì)該抗原的特異抗體滴度的水平，由于獻(xiàn)漿員針對(duì)疫苗的免疫效果不同和抗體水平不同，因此，《歐洲藥典》和《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版檢測(cè)IVIG的Fc段生物學(xué)活性的抗原種類不同。該項(xiàng)研究引入麻疹病毒、乙型肝炎表面抗原、破傷風(fēng)類毒素和腦膜炎球菌P64k蛋白這4個(gè)非藥典收載的抗原，表明用多種抗原分別致敏紅細(xì)胞可用來檢測(cè)IVIG 中多種抗體的Fc 段生物學(xué)活性，為IVIG 制品中多種抗體Fc 段生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。

敏化紅細(xì)胞的抗原一般為類毒素或病毒，具有一定的環(huán)境危害性、批間質(zhì)量差異性較大造成敏化效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。陳晨等[8]發(fā)明一項(xiàng)專利，采用更易獲得的且具有良好穩(wěn)定性的重組合成肽段(蛋白)類抗原，如重組風(fēng)疹抗原E1或重組白喉CRM197，進(jìn)行IVIG的Fc段生物學(xué)活性檢定，且由于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版方法采用吸光度測(cè)定法易受樣品的澄明度、補(bǔ)體的批次等條件的影響，不利于數(shù)據(jù)的回顧性分析，因此對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法直觀檢測(cè)紅細(xì)胞溶血，檢測(cè)結(jié)果的精密度為3.074%?！稓W洲藥典》檢測(cè)結(jié)果的精密度為17.313%，采用重組風(fēng)疹抗原E1或重組白喉CRM197具有可行性。

雷敏等[9]考察重組乙型肝炎疫苗致敏紅細(xì)胞，該抗原的溶血?jiǎng)恿W(xué)曲線幾乎沒有波動(dòng)，未發(fā)生溶血反應(yīng)；同時(shí)考察《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版推薦的白喉類毒素抗原，溶血反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線呈現(xiàn)明顯的“S”型，結(jié)果表明，濃度在50～150 Lf·mL-1時(shí)檢測(cè)結(jié)果良好，因此，試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然乙型肝炎表面抗原進(jìn)行Fc段生物學(xué)活性檢測(cè)具有可行性，但采用重組乙型肝炎疫苗致敏紅細(xì)胞的檢測(cè)方法暫不可行。

破傷風(fēng)類毒素作為抗原可引起強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生較高滴度的抗體，且破傷風(fēng)檢測(cè)屬于多國(guó)規(guī)定的免疫項(xiàng)目。因此，VRDOLJAK等[10]考察破傷風(fēng)類毒素作為抗原進(jìn)行Fc生物學(xué)活性檢測(cè)的可行性，研究發(fā)現(xiàn)，IVIG制劑的破傷風(fēng)抗體滴度的批間差異不影響檢測(cè)結(jié)果，且該方法的精密度達(dá)±5%。比較破傷風(fēng)類毒素抗原與《歐洲藥典》規(guī)定的風(fēng)疹病毒抗原的檢測(cè)結(jié)果，測(cè)定IVIG樣品7份，兩種方法平均差值為3.1%。該項(xiàng)研究中關(guān)于破傷風(fēng)類毒素用于Fc生物活性檢測(cè)的可行性結(jié)論，與席亮等[7]研究結(jié)論一致。

2.2敏化紅細(xì)胞制備 《中華人民共和國(guó)藥典》2015版收載的Fc段生物學(xué)活性檢測(cè)方法中，敏化紅細(xì)胞制備方法要求牛白蛋白-巴比妥緩沖液懸浮紅細(xì)胞的濃度規(guī)定：波長(zhǎng)541 nm處吸光度(A541)為1.0±0.1，《歐洲藥典》的規(guī)定與《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版相同。劉曉等[11]考察Fc段生物學(xué)活性檢測(cè)方法中敏化紅細(xì)胞的密度和敏化紅細(xì)胞貯存時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果顯示細(xì)胞密度A541為0.3，0.5，1.0，1.3，1.5，2.0時(shí)，IFc依次為68%，66%，62%，73%，51%，52%，紅細(xì)胞密度A541為1.3時(shí)，測(cè)定的結(jié)果最高。致敏紅細(xì)胞貯存1～5 d時(shí)結(jié)果較為穩(wěn)定，第1，2，3和5天的檢測(cè)結(jié)果依次為88%，82%，84%，88%，而第7天時(shí)檢測(cè)結(jié)果為100%，結(jié)果偏高，因此建議致敏紅細(xì)胞貯存時(shí)間應(yīng)不超過5 d。雷敏等[9]考察敏化紅細(xì)胞對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，當(dāng)A541為1.0時(shí)，測(cè)定的檢測(cè)結(jié)果較高。大部分文獻(xiàn)中敏化紅細(xì)胞的密度與《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定基本一致，劉曉等[11]等認(rèn)為A541為1.3時(shí)檢測(cè)結(jié)果最高，說明吸光度為Fc段生物學(xué)活性的影響因素，應(yīng)注意平行比較時(shí)敏化紅細(xì)胞濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.3補(bǔ)體效價(jià)和溶血反應(yīng)檢測(cè)方法 添加補(bǔ)體的用量，《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定為150 CH50·mL-1，《歐洲藥典》規(guī)定為125～200 CH50·mL-1，雷敏等[9]采用白喉類毒素進(jìn)行補(bǔ)體效價(jià)的考察，以溶血?jiǎng)恿W(xué)曲線是否呈現(xiàn)明顯“S”型為判斷標(biāo)準(zhǔn)，提出補(bǔ)體效價(jià)≥50 CH50·mL-1時(shí)均能獲得較好的溶血反應(yīng)曲線。

2.4溶血反應(yīng)檢測(cè)方法 《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版采用紫外-可見分光光度法檢測(cè)，《歐洲藥典》同時(shí)收載紫外-可見分光光度法和微孔板光度法。劉曉等[11]考察手工紫外-可見分光光度計(jì)和微孔板光度法對(duì)結(jié)果的影響，對(duì)同一批樣品的10次結(jié)果重復(fù)性進(jìn)行考察，兩種檢測(cè)結(jié)果相近，其中微孔板的變異系數(shù)相對(duì)較低。VRDOIJAK等[10]考察微孔板光度方法同時(shí)檢測(cè)白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素的Fc段生物學(xué)活性，結(jié)果精密度良好。

3 結(jié)束語

人免疫球蛋白Fc段生物學(xué)活性主要有激活補(bǔ)體、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用以及通過胎盤的的被動(dòng)免疫等，通常要求IVIG的生產(chǎn)工藝盡可能少修飾IgG，保留IgG分子的完整性，盡可能保留Fc段的生物學(xué)活性。靜注人免疫球蛋白(pH 4)為《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版收載品種，所采用的生產(chǎn)工藝應(yīng)能使制品中IgG亞類齊全，其值與正常人血清IgG亞類分布相近，應(yīng)能保留IgG的Fc段生物學(xué)活性，并在通則中提供Fc段生物學(xué)活性檢測(cè)方法。

《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版中人免疫球蛋白Fc 段生物學(xué)活性檢測(cè)方法為激活補(bǔ)體檢測(cè)方法，相關(guān)文獻(xiàn)提供采用了重組抗原進(jìn)行檢測(cè)的研究數(shù)據(jù)，也提供其他類型抗原，如破傷風(fēng)類毒素等研究數(shù)據(jù)；關(guān)于敏化紅細(xì)胞方面，考察敏化紅細(xì)胞的濃度，基本與《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版規(guī)定一致，同時(shí)考察敏化紅細(xì)胞的貯存條件，為試驗(yàn)操作的靈活性提供數(shù)據(jù)支持；補(bǔ)體效價(jià)方面，文獻(xiàn)中提出≥50CH50·mL-1均能獲得較好的溶血反應(yīng)曲線；關(guān)于溶血反應(yīng)檢測(cè)方法方面，微孔板光度法變異性低，精密度良好，可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品檢測(cè)，提高檢測(cè)效率。人免疫球蛋白Fc 段生物學(xué)活性檢測(cè)方法激活補(bǔ)體方法為標(biāo)準(zhǔn)方法，在實(shí)際首次應(yīng)用時(shí)，應(yīng)對(duì)該方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)尿?yàn)證，如進(jìn)行專屬性和精密度的驗(yàn)證，以便證明在實(shí)際的使用條件下該方法也適用。