賈燕花

(國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022)

血液制品是由人類血液或血漿制備成的治療產(chǎn)品，《中華人民共和國藥典》2015年版收載品種有人血白蛋白、人免疫球蛋白等[1]。其中靜注人免疫球蛋白(IVIG)制品是從1000名以上供血漿者的血漿混合物制備而成，具有免疫替代和調(diào)節(jié)的雙重作用，目前被廣泛用于感染性疾病和自身免疫性疾病的治療[2]。

IVIG制品的臨床療效與其生物學功能密不可分，第1代和第2代IVIG生產(chǎn)方法均會損害人免疫球蛋白的Fc片段，進而影響其生物學功能[3]、制品的存放會導致人IgGFc段生物活性降低和退化，且實際生產(chǎn)工藝中有多種因素會影響Fc段生物學活性，因此需要對人免疫球蛋白進行Fc段的生物學活性檢測?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版三部也規(guī)定Fc 段生物學活性檢測方法[1]，且《中華人民共和國藥典》2015年版引入供試品激活補體的功能指數(shù)應不低于國家參考品活性的60%的要求。

目前報道有多種人免疫球蛋白Fc段生物學活性檢測方法，如激活補體試驗、結(jié)合Fc 受體的調(diào)理活性試驗、巨噬細胞吞噬細菌作用試驗、紅細胞玫瑰花形成抑制試驗、靜注人免疫球蛋白與葡萄球菌A 蛋白結(jié)合試驗、靜注人免疫球蛋白與Fc 特異單抗結(jié)合試驗及單向散射擴散溶血試驗等[4]?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版和《歐洲藥典》[5]均采用激活補體檢測方法，該方法具有干擾因素較少、操作較簡單、檢測結(jié)果較準確等特點，但也受一些因素的影響，如檢測原理中采用單點標準品、供試品中抗體滴度、IgG亞型、抗原的種類及效價、補體的反應條件(補體效價、反應溫度、抗原的致敏效價等)等[6]。筆者主要闡述激活補體檢測方法的研究進展，就抗原、敏化紅細胞、補體效價、檢測方式等進行綜述，為IVIG制品的質(zhì)量控制提供參考。

1 人免疫球蛋白Fc生物學活性檢測方法的比較

《中華人民共和國藥典》2015年版和《歐洲藥典》均收載Fc段生物學活性檢測方法，檢測方法的原理相同，檢測步驟和溶血反應檢測方法存在差異。

1.1抗原方面 《中華人民共和國藥典》2015年版僅在敏化紅細胞方法中表述了用磷酸鹽緩沖液(PBS)適當稀釋的白喉類毒素或腮腺炎病毒，無滴度要求，《歐洲藥典》中規(guī)定風疹抗原的滴度>256HA units。

1.2敏化紅細胞制備方面 在紅細胞來源、紅細胞懸液制備方法等方面均有差異。①《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定人抗凝O型血要求3人份以上混合，而未規(guī)定貯存條件，《歐洲藥典》中存儲條件要求為在4 ℃條件下≤3周。②紅細胞懸液制備方法，《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定分離紅細胞，取適量壓積紅細胞懸浮于1.3 mg·L-1鞣酸PBS(1：40)，37 ℃水浴輕搖30 min，洗滌后用PBS制備成2.5%紅細胞懸液；《歐洲藥典》規(guī)定分離后紅細胞以2%(V/V)懸浮于PBS(pH值7.2)中，將1體積的鞣酸溶液與1體積的人紅細胞懸液混合，37 ℃孵育10 min，洗滌后用PBS制備成1%紅細胞懸液。③敏化抗原的制備，《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定紅細胞懸液與抗原溶液混合比例為1：4，混合后置于37 ℃水浴中輕搖30 min；《歐洲藥典》規(guī)定每毫升鞣酸化紅細胞添加風疹抗原0.2 mL，置于37 ℃水浴孵育30 min，同時規(guī)定初始測定吸光度混合，按照敏化紅細胞懸液100 μL和白蛋白-巴比妥緩沖液900 μL混合測定。

1.3補體方面 《中華人民共和國藥典》2015年版僅在測定法中體現(xiàn)補體用量，每毫升含補體150 CH50，未提供補體的制備方法和貯存條件?！稓W洲藥典》規(guī)定豚鼠補體從不低于10只豚鼠的血液制備，提供制備方法和貯存條件，用量為每毫升含補體125～200 CH50。

1.4供試品和參考品制備方法 兩者在供試品制備，濃度規(guī)定方面有差異，《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定將供試品pH值調(diào)節(jié)至6.8～7.0，再用牛白蛋白-巴比妥緩沖液將供試品IgG濃度稀釋至每毫升含40 mg；《歐洲藥典》中規(guī)定，將供試品用白蛋白-巴比妥緩沖液稀釋獲得免疫球蛋白30～40 mg，并用白蛋白-巴比妥緩沖液獲得最終體積為900 μL的溶液。參考品的制備方法均同供試品。

1.5檢測方式 《中華人民共和國藥典》2015年版采用紫外-可見分光光度法檢測，《歐洲藥典》中同時收載紫外-可見分光光度法和微孔板光度法兩種溶血反應檢測方法。檢測方法中，供試品和敏化紅細胞混懸液混合后的處置條件不一致，《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定置37 ℃水浴中輕搖30 min，《歐洲藥典》規(guī)定為靜置15 min。

2 Fc段生物學活性測定法的優(yōu)化

2.1抗原的種類和效價激活 補體是通過抗體的Fab段與相應的抗原結(jié)合后，IgG暴露出Fc結(jié)合C1q的補體結(jié)合點，啟動補體激活系統(tǒng)，從而能有效的和快速的殺死病原菌。人免疫球蛋白Fc段生物學活性測定法是通過與紅細胞上已包被的相應抗原結(jié)合，激活補體后最終導致紅細胞的細胞膜受到攻擊、破裂，從而釋放出血紅蛋白，由溶血反應動力學曲線來測定。關于紅細胞上的包被抗原，《歐洲藥典》相應方法中推薦采用風疹病毒抗原，《中華人民共和國藥典》2015年版的相應方法中推薦采用白喉類毒素或腮腺炎病毒，且《歐洲藥典》和《中華人民共和國藥典》2015年版方法中均僅考察一種抗原特異抗體的Fc段生物學活性。

席亮等[7]分別考察白喉類毒素、風疹病毒、麻疹病毒、乙型肝炎表面抗原、破傷風類毒素和腦膜炎球菌P64k蛋白等6種抗原對Fc段生物學活性檢測結(jié)果的影響，重復性比較穩(wěn)定，檢測結(jié)果依次為129%，132%，117%，98%，82%和118%，均高于80%，同一批次樣品Fc段生物學活性檢測結(jié)果差別較大，推測是由于供試品中不同抗原抗體滴度不同造成的?！稓W洲藥典》和《中華人民共和國藥典》2015年版采用不同的抗原，表明Fc段生物學活性檢測抗原的選擇應該考慮供試品中針對該抗原的特異抗體滴度的水平，由于獻漿員針對疫苗的免疫效果不同和抗體水平不同，因此，《歐洲藥典》和《中華人民共和國藥典》2015年版檢測IVIG的Fc段生物學活性的抗原種類不同。該項研究引入麻疹病毒、乙型肝炎表面抗原、破傷風類毒素和腦膜炎球菌P64k蛋白這4個非藥典收載的抗原，表明用多種抗原分別致敏紅細胞可用來檢測IVIG 中多種抗體的Fc 段生物學活性，為IVIG 制品中多種抗體Fc 段生物學活性奠定了基礎。

敏化紅細胞的抗原一般為類毒素或病毒，具有一定的環(huán)境危害性、批間質(zhì)量差異性較大造成敏化效果不穩(wěn)定等缺點。陳晨等[8]發(fā)明一項專利，采用更易獲得的且具有良好穩(wěn)定性的重組合成肽段(蛋白)類抗原，如重組風疹抗原E1或重組白喉CRM197，進行IVIG的Fc段生物學活性檢定，且由于《中華人民共和國藥典》2015年版方法采用吸光度測定法易受樣品的澄明度、補體的批次等條件的影響，不利于數(shù)據(jù)的回顧性分析，因此對檢測方法進行優(yōu)化，采用細胞計數(shù)法直觀檢測紅細胞溶血，檢測結(jié)果的精密度為3.074%?！稓W洲藥典》檢測結(jié)果的精密度為17.313%，采用重組風疹抗原E1或重組白喉CRM197具有可行性。

雷敏等[9]考察重組乙型肝炎疫苗致敏紅細胞，該抗原的溶血動力學曲線幾乎沒有波動，未發(fā)生溶血反應；同時考察《中華人民共和國藥典》2015年版推薦的白喉類毒素抗原，溶血反應動力學曲線呈現(xiàn)明顯的“S”型，結(jié)果表明，濃度在50～150 Lf·mL-1時檢測結(jié)果良好，因此，試驗結(jié)果表明，雖然乙型肝炎表面抗原進行Fc段生物學活性檢測具有可行性，但采用重組乙型肝炎疫苗致敏紅細胞的檢測方法暫不可行。

破傷風類毒素作為抗原可引起強烈的T細胞免疫應答，產(chǎn)生較高滴度的抗體，且破傷風檢測屬于多國規(guī)定的免疫項目。因此，VRDOLJAK等[10]考察破傷風類毒素作為抗原進行Fc生物學活性檢測的可行性，研究發(fā)現(xiàn)，IVIG制劑的破傷風抗體滴度的批間差異不影響檢測結(jié)果，且該方法的精密度達±5%。比較破傷風類毒素抗原與《歐洲藥典》規(guī)定的風疹病毒抗原的檢測結(jié)果，測定IVIG樣品7份，兩種方法平均差值為3.1%。該項研究中關于破傷風類毒素用于Fc生物活性檢測的可行性結(jié)論，與席亮等[7]研究結(jié)論一致。

2.2敏化紅細胞制備 《中華人民共和國藥典》2015版收載的Fc段生物學活性檢測方法中，敏化紅細胞制備方法要求牛白蛋白-巴比妥緩沖液懸浮紅細胞的濃度規(guī)定：波長541 nm處吸光度(A541)為1.0±0.1，《歐洲藥典》的規(guī)定與《中華人民共和國藥典》2015年版相同。劉曉等[11]考察Fc段生物學活性檢測方法中敏化紅細胞的密度和敏化紅細胞貯存時間對結(jié)果的影響，結(jié)果顯示細胞密度A541為0.3，0.5，1.0，1.3，1.5，2.0時，IFc依次為68%，66%，62%，73%，51%，52%，紅細胞密度A541為1.3時，測定的結(jié)果最高。致敏紅細胞貯存1～5 d時結(jié)果較為穩(wěn)定，第1，2，3和5天的檢測結(jié)果依次為88%，82%，84%，88%，而第7天時檢測結(jié)果為100%，結(jié)果偏高，因此建議致敏紅細胞貯存時間應不超過5 d。雷敏等[9]考察敏化紅細胞對檢測結(jié)果的影響，當A541為1.0時，測定的檢測結(jié)果較高。大部分文獻中敏化紅細胞的密度與《中華人民共和國藥典》中規(guī)定基本一致，劉曉等[11]等認為A541為1.3時檢測結(jié)果最高，說明吸光度為Fc段生物學活性的影響因素，應注意平行比較時敏化紅細胞濃度對試驗結(jié)果的影響。

2.3補體效價和溶血反應檢測方法 添加補體的用量，《中華人民共和國藥典》規(guī)定為150 CH50·mL-1，《歐洲藥典》規(guī)定為125～200 CH50·mL-1，雷敏等[9]采用白喉類毒素進行補體效價的考察，以溶血動力學曲線是否呈現(xiàn)明顯“S”型為判斷標準，提出補體效價≥50 CH50·mL-1時均能獲得較好的溶血反應曲線。

2.4溶血反應檢測方法 《中華人民共和國藥典》2015年版采用紫外-可見分光光度法檢測，《歐洲藥典》同時收載紫外-可見分光光度法和微孔板光度法。劉曉等[11]考察手工紫外-可見分光光度計和微孔板光度法對結(jié)果的影響，對同一批樣品的10次結(jié)果重復性進行考察，兩種檢測結(jié)果相近，其中微孔板的變異系數(shù)相對較低。VRDOIJAK等[10]考察微孔板光度方法同時檢測白喉類毒素和破傷風類毒素的Fc段生物學活性，結(jié)果精密度良好。

3 結(jié)束語

人免疫球蛋白Fc段生物學活性主要有激活補體、抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用以及通過胎盤的的被動免疫等，通常要求IVIG的生產(chǎn)工藝盡可能少修飾IgG，保留IgG分子的完整性，盡可能保留Fc段的生物學活性。靜注人免疫球蛋白(pH 4)為《中華人民共和國藥典》2015年版收載品種，所采用的生產(chǎn)工藝應能使制品中IgG亞類齊全，其值與正常人血清IgG亞類分布相近，應能保留IgG的Fc段生物學活性，并在通則中提供Fc段生物學活性檢測方法。

《中華人民共和國藥典》2015年版中人免疫球蛋白Fc 段生物學活性檢測方法為激活補體檢測方法，相關文獻提供采用了重組抗原進行檢測的研究數(shù)據(jù)，也提供其他類型抗原，如破傷風類毒素等研究數(shù)據(jù)；關于敏化紅細胞方面，考察敏化紅細胞的濃度，基本與《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定一致，同時考察敏化紅細胞的貯存條件，為試驗操作的靈活性提供數(shù)據(jù)支持；補體效價方面，文獻中提出≥50CH50·mL-1均能獲得較好的溶血反應曲線；關于溶血反應檢測方法方面，微孔板光度法變異性低，精密度良好，可同時進行多個樣品檢測，提高檢測效率。人免疫球蛋白Fc 段生物學活性檢測方法激活補體方法為標準方法，在實際首次應用時，應對該方法進行適當?shù)尿炞C，如進行專屬性和精密度的驗證，以便證明在實際的使用條件下該方法也適用。