趙 晶，李彥杰*，周厚勤，任 錕，邢若星

（1.河南省中醫(yī)院康復(fù)科，河南 鄭州 450002； 2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院康復(fù)科，河南 鄭州 450052）

缺血性腦血管疾病是一種全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類生命的重大疾病，當(dāng)血流量減少或受阻時(shí)，大腦的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，導(dǎo)致缺血性中風(fēng)［1］。目前隨著溶栓治療的開展和應(yīng)用，阻塞的血管能夠再通，使腦組織恢復(fù)足夠的血流，挽救了一些患者的生命，但是在血流增加時(shí)可能導(dǎo)致部分患者腦組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常，進(jìn)而加重病情。大腦缺血再灌注可能誘發(fā)神經(jīng)元損傷，其涉及到的機(jī)制主要有鈣超載、氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等［2］。

麥冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-GawL 是百合科沿階草屬多年生常綠草本植物，其塊根有生津解渴、潤(rùn)肺止咳之效。麥冬的有效成分主要有甾體皂苷、高異黃酮、氨基酸和多糖等。其中甾體皂苷和高異黃酮是麥冬的主要活性成分，具有抗疲勞、清除自由基、抗炎、抗血栓形成、抗腫瘤等作用［3-4］。本研究以PC12 細(xì)胞株為研究對(duì)象，建立缺氧復(fù)氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）損傷模型，給予甲基麥冬黃烷酮A（methylophiopogonanone A，MO-A）處理，通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡及氧化損傷考察MOA 對(duì)PC12 細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用，為MO-A 在腦血管疾病中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；MO-A 購(gòu)自上海融禾科技有限公司；CCK-8 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒、LDH 細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、BrdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；caspase-3 活性試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehydc，MDA）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche 公司；caspase-3 抗體和β-actin 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；辣根過(guò)氧化酶二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 PC12 細(xì)胞接種于96 孔板中，培養(yǎng)于含有10% FBS 及1%青霉素／鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行傳代。此外，采用DMSO 配制濃度為50 mmol／L 的MO-A 母液，分裝保存，使用時(shí)采用細(xì)胞培養(yǎng)液按照細(xì)胞分組稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度。

細(xì)胞分為5 組：（1）對(duì)照組，正常條件下培養(yǎng)PC12細(xì)胞；（2）模型組，PC12 培養(yǎng)在低糖RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于5% CO2、95% N2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，更換為正常培養(yǎng)基后置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，建立H／R 損傷模型；（3）1 μmol／L MO-A＋模型組，采用1 μmol／L MO-A 預(yù)處理 1 h，進(jìn)行 H／R 處理；（4）10 μmol／L MO-A＋模型組，采用10 μmol／L MO-A 預(yù)處理1 h，進(jìn)行H／R 處理；（5）50 μmol／L MO-A＋模型組，采用50 μmol／L MO-A 預(yù)處理1 h，進(jìn)行H／R 處理。

1.2.2 CCK8 測(cè)定細(xì)胞活性 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔加入100 μL 培養(yǎng)基，各組給予相應(yīng)的處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每孔加入10 μL CCK8 溶液，于37 ℃反應(yīng)2.5 h，以650 nm為參考波長(zhǎng)，采用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定吸光度（A），細(xì)胞存活率按照以下公式計(jì)算：存活率＝［（A實(shí)驗(yàn)-A空白）／（A對(duì)照－A空白）］×100%。

1.2.3 LDH 釋放測(cè)定 細(xì)胞接種于96 孔板中，各組給予相應(yīng)的處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 h，棄培養(yǎng)基，加入110 μL（含10 μL LDH 釋放試劑），于37 ℃孵育1 h，在多孔板離心機(jī)中400×g離心5 min，移取上清液至新培養(yǎng)板，按照說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 BrdU 摻入量測(cè)定 細(xì)胞接種于96 孔板中，各組給予相應(yīng)的處理，按照BrdU 試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞中BrdU摻入量。

1.2.5 Cell Death Detectioin ELISA 測(cè)定細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于24 孔板中，各組細(xì)胞給予相應(yīng)的處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞核，按照說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 caspase-3 活性測(cè)定 細(xì)胞接種于6 孔板中，各組給予相應(yīng)的處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按照說(shuō)明書測(cè)定caspase-3活性。

1.2.7 SOD、CAT 活性測(cè)定 各組細(xì)胞給予相應(yīng)的處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集細(xì)胞，按照說(shuō)明書對(duì)SOD、CAT 活性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 MDA 水平測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗3 次，加入裂解液裂解細(xì)胞。12 000×g離心15 min，用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白量。根據(jù)該檢測(cè)試劑盒的方向測(cè)定MDA 水平，結(jié)果以nmol／mg 蛋白表示。

1.2.9 蛋白印跡法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測(cè)定各組樣品的蛋白濃度，每孔上樣量50 μg，在SDS-PAGE 上進(jìn)行電泳，目的蛋白分開后，200 mA 轉(zhuǎn)膜1.5 h，以5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃過(guò)夜孵育抗caspase3、β-actin 蛋白，室溫孵育二抗1 h，加入發(fā)光液，進(jìn)行顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 11.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MO-A 對(duì)細(xì)胞活性的影響 PC12 細(xì)胞給予不同濃度（1、10、50 μmol／L）MO-A 處理24 h 后，考察MO-A 對(duì)細(xì)胞活性是否有影響。如圖1A 所示，不同濃度MO-A 對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯作用，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。BrdU 測(cè)定細(xì)胞增殖結(jié)果如圖1B 所示，與對(duì)照組比較，MO-A 處理組細(xì)胞增殖率無(wú)變化（P＞0.05）。由此表明，MO-A 對(duì)PC12 細(xì)胞活性及增殖無(wú)明顯作用。

圖1 MO-A 對(duì)細(xì)胞活性及增殖的影響

2.2 MO-A 降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞活性損傷 細(xì)胞給予不同濃度（1、10、50 μmol／L）MO-A 預(yù)處理1 h 后，進(jìn)行缺氧復(fù)氧損傷，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖及LDH 釋放評(píng)價(jià)MO-A 對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的作用。如圖2A 所示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞活性降低（P＜0.05），MO-A 處理組細(xì)胞活性較模型組升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性。與模型組比較，1、10、50 μmol／L MO-A 處理均可促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖2B，P＜0.05），且50 μmol／L＋模型組細(xì)胞增殖率最高。上清液中LDH 釋放能夠反映細(xì)胞損傷程度，如圖2C所示，模型組LDH 釋放率較對(duì)照組升高（P＜0.05），MO-A預(yù)處理LDH 釋放減少（P＜0.05），呈一定劑量依賴性。

2.3 MO-A 降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、caspase-3 活性及c-caspase-3 蛋白表達(dá)水平評(píng)價(jià)MO-A 對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。如圖3A 所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），給予MO-A 處理后，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），且50 μmol／L 處理組最低。MO-A 處理后，PC12 細(xì)胞caspase3 活性較模型組降低（圖3B，P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性。此外，與模型組比較，MO-A 處理組c-caspase3 蛋白表達(dá)降低（圖3C，P＜0.05），呈劑量依賴性。由此表明，MO-A 能夠抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖2 MO-A 抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

圖3 MO-A 降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2.4 MO-A 降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)氧化損傷 通過(guò)檢測(cè)SOD、CAT 活性及MDA 水平評(píng)價(jià)PC12 細(xì)胞的氧化損傷。如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組SOD、CAT 活性降低，給予MO-A 處理后升高（P＜0.05），有一定劑量依賴性。此外，缺氧復(fù)氧損傷導(dǎo)致MDA 水平增加（P＜0.05），而MO-A預(yù)處理組降低（P＜0.05）。由此表明，MO-A 能夠降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞的氧化損傷。

3 討論

近年來(lái)，有多種天然產(chǎn)物在腦缺血相關(guān)疾病中發(fā)揮保護(hù)作用，如三七皂苷Rg1［5］、白藜蘆醇［6］和芍藥苷［7］等。麥冬作為一種常用的中藥材之一，在多種疾病中具有保護(hù)作用，其有效成分麥冬多糖具有抗急性心肌缺血［8］及減輕腦缺血損傷［9］的作用。MO-A 作為麥冬中另一有效成分，能夠減少心肌缺血再灌注損傷［10］。但是MO-A 對(duì)PC12 細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用尚未報(bào)道，本研究中，考察MO-A對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞活性、凋亡及氧化損傷的作用。

首先，單獨(dú)給予MO-A 處理PC12 細(xì)胞考察MO-A 對(duì)細(xì)胞活性是否有損傷作用，結(jié)果顯示，MO-A 對(duì)細(xì)胞活性及增殖無(wú)明顯作用。在H／R 損傷模型中，MO-A 預(yù)處理降低細(xì)胞損傷，表明MO-A 對(duì)PC12 細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用。有報(bào)道顯示，MO-A 抑制心肌細(xì)胞系H9C2 細(xì)胞活性降低［10］。

許多研究表明，腦缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響大腦正常的功能，引起不可逆的損傷，因此，減小或阻礙神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)腦缺血再灌注損傷具有重要的意義。在心肌缺血再灌注損傷模型中，MO-A 顯著降低心肌細(xì)胞凋亡，且MO-A 通過(guò)降低血腦屏障通透性保護(hù)腦組織缺血再灌注損傷［11］。本研究發(fā)現(xiàn)MO-A 預(yù)處理降低細(xì)胞凋亡率和caspase3 活性、并抑制c-caspase3 蛋白表達(dá)，且呈現(xiàn)劑量依賴性，表明MO-A 能夠抑制PC12 細(xì)胞凋亡，減少缺氧復(fù)氧損傷。

圖4 MO-A 降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)氧化損傷

氧化應(yīng)激廣泛參與了許多病理生理過(guò)程，如衰老、炎癥及腫瘤發(fā)生［12］。大量證據(jù)表明，ROS 過(guò)度生成引起的氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。因此，降低氧化應(yīng)激被認(rèn)為是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵機(jī)制［12］。MOA 已被證實(shí)能夠降低ROS 的產(chǎn)生［11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MO-A預(yù)處理可抑制PC12 細(xì)胞SOD 和CAT 活性的降低、并對(duì)抗MDA 水平的升高，提示MO-A能減輕缺氧復(fù)氧損傷后神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

綜上所述，MO-A 對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這與其抗凋亡及抗氧化的活性有關(guān)，本研究為該成分在缺血性腦病防治中的應(yīng)用提供了新的思路和方法。