錢蘇海，蔡斯琦，丁興紅，丁志山，范永升

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

蘄蛇為蝰科動物尖吻蝮Agkistrodon acutus的干燥體，其性味甘、咸、溫，歸肝經(jīng)［1］，廣泛應(yīng)用于治療風濕頑痹，如類風濕關(guān)節(jié)炎、肢體麻木、關(guān)節(jié)腫脹等。前期研究發(fā)現(xiàn)，蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白具有良好的治療類風濕關(guān)節(jié)炎作用［2-4］，但其腥味重，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，藥物作用時間短，制約了臨床推廣應(yīng)用。

以殼聚糖-海藻酸鹽為囊材包埋蛋白是一種新型制藥技術(shù)，它有助于保持蛋白類藥物的生物活性［5-6］，提高膠囊穩(wěn)定性和載藥量，并可調(diào)節(jié)藥物釋放速度，實現(xiàn)緩釋性能，具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前，尚無制備蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白殼聚糖-海藻酸鹽納米膠囊的報道，故本實驗通過反相乳化法制備該制劑，正交試驗優(yōu)化其工藝，并對其理化性質(zhì)進行表征，藥物釋藥性能進行考察，從而為相關(guān)新型給藥系統(tǒng)的研發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析儀、Zeta 電位儀（英國Malvern 公司）；H-7650 透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；酶標儀（美國Thermo 公司）；磁力攪拌器（德國IKA 公司）。海藻酸鈉、乙酸、氫氧化鈉、PBS 緩沖液，氯化鈣均為分析純（上海阿拉丁試劑有限公司）；透析袋（截留分子量10 000）、殼聚糖（生物技術(shù)級，脫乙酰度≥95%）（上海麥克林生化科技有限公司）；水為雙蒸水（美國Millipore 公司）。蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白［7］（自制，含有量95%）。

2 方法

2.1 納米膠囊制備 100 mg 海藻酸碾碎，轉(zhuǎn)移到0.5%乙酸中溶解，加入Ⅱ型膠原蛋白凍干粉超聲溶解，再加入CaCl2溶液超聲乳化完全，緩慢滴加0.5 mol／L NaOH 將pH值調(diào)至7.5，得到海藻酸鈣Ⅱ型膠原蛋白納米膠囊，將其洗滌離心后加到殼聚糖溶液中磁力攪拌2 h，即得。

2.2 透射電鏡觀察 將分散于去離子水的蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白納米膠囊滴于200 目噴碳銅網(wǎng)上，室溫干燥后滴加數(shù)微升2% 磷鎢酸鈉負染液，靜置后濾紙吸去負染液，干燥30 min后進行電鏡觀察。

2.3 粒徑、Zeta 電位測定 應(yīng)用激光納米粒徑儀檢測粒徑、Zeta 電位，觀察粒徑分布范圍。

2.4 載藥量、包封率、釋藥性能測定

2.4.1 載藥量 精密稱取納米膠囊適量（C2）于研缽中研細，適量PBS 緩沖液（0.1 mol／L，pH＝7.2）混勻，待其充分溶脹后再劇烈攪拌30 min，使蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白充分溶出，濾液定容后采用羥脯氨酸法測定羥脯氨酸質(zhì)量濃度，乘以系數(shù)7.46 即為其含有量（C1），計算載藥量，公式為載藥量＝C1／C2×100%。

2.4.2 包封率 取納米膠囊約100 mg 于50 mL 量瓶中，PBS 緩沖液（0.1 mol／L，pH＝7.2）定容，待其充分溶脹后離心取上清液，羥脯氨酸法測定上清液蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白質(zhì)量（C3），沉淀置于研缽中研細，加適量PBS 緩沖液劇烈攪拌30 min，以使蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白充分溶出，羥脯氨酸法測定其質(zhì)量（C4），計算包封率，公式為包封率＝［C4／（C4＋C3）］×100%。

2.4.3 釋藥性能 100 mg 海藻酸碾碎，轉(zhuǎn)移到150 mL 0.5%乙酸中，加入100 mg Ⅱ型膠原蛋白超聲乳化，得到微乳溶液，將它和納米膠囊置于含有人工胃液浸液的透析袋內(nèi)，放入生理鹽水中，在不同時間點取樣，羥脯氨酸法測定蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白質(zhì)量濃度，計算藥物累積釋放率，同時加入等量新鮮人工胃液保持恒定體積。

3 結(jié)果

3.1 制備工藝優(yōu)化 因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 方差分析

由表可知，蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白與海藻酸比例對粒徑、Zeta 電位影響最大，殼聚糖溶液濃度次之，CaCl2溶液濃度影響最?。蛔顑?yōu)工藝 為A3B2C3，即CaCl2溶液濃度20 mmol／L，蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白與海藻酸比例1∶1，殼聚糖溶液濃度1%。再進行3 批驗證試驗，測定平均粒徑為（210±5.12）nm，PDI 為0.16±0.03，Zeta 電位為（－25.46±0.56）mV，粒徑分布見圖1。

圖1 蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白納米膠囊的粒徑分布

3.2 微觀形態(tài) 圖2 顯示，納米膠囊大小均勻，分散性好，表面光滑飽滿。

圖2 納米膠囊透射電鏡圖

3.3 載藥量、包封率 納米膠囊平均包封率、載藥量分別為（83.69±4.31）%、（16.35±1.35）%。

3.4 釋藥性能 圖3 顯示，納米膠囊24 h 累積釋放率為（81.86±3.15）%，實現(xiàn)了緩釋作用；蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白釋放的總體趨勢是先快后慢，12 h 時微乳釋放率不大于55%，而此時納米膠囊已達到95%。

圖3 樣品釋藥性能曲線

4 討論

本實驗通過正交設(shè)計［8］獲得蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白納米膠囊最優(yōu)參數(shù)，此時所得制劑性能優(yōu)良，具有良好的穩(wěn)定性和粒徑分布范圍，并且表面光滑飽滿，這是因為在形成過程中蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白首先被海藻酸表層富集，之后海藻酸中α-L-古羅糖醛酸單元與CaCl2中鈣離子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，逐步形成帶負電荷海藻酸鈣囊殼，它在帶正電荷的殼聚糖溶液中受靜電作用而進一步成型［9］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該制劑具有的良好藥物包封性能，這是因為膠囊囊芯中蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白在海藻酸鈣與殼聚糖的共同包埋下，由于海藻酸與鈣離子交聯(lián)度反應(yīng)而使囊膜致密性增加，兩者一起形成致密的納米膠囊網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致它從基質(zhì)滲透到外界環(huán)境溶液的難度加大，避免了藥物泄漏損失，從而具有良好的包封率［10-11］。另外，還測得其平均載藥量大于15%，具有一定的臨床應(yīng)用價值。

蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白緩釋納米膠囊具有良好的緩釋效果，這可能是由于海藻酸與蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白之間受氫鍵與靜電作用，使得其結(jié)構(gòu)更致密，可抑制藥物擴散速率［12］，從而實現(xiàn)了該作用。