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        蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白海藻酸鈣-殼聚糖納米膠囊的制備

        2020-02-18 12:43:32錢蘇海蔡斯琦丁興紅丁志山范永升
        中成藥 2020年1期
        關(guān)鍵詞:羥脯氨酸藥量膠原蛋白

        錢蘇海,蔡斯琦,丁興紅,丁志山,范永升

        (浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州 310053)

        蘄蛇為蝰科動物尖吻蝮Agkistrodon acutus的干燥體,其性味甘、咸、溫,歸肝經(jīng)[1],廣泛應(yīng)用于治療風濕頑痹,如類風濕關(guān)節(jié)炎、肢體麻木、關(guān)節(jié)腫脹等。前期研究發(fā)現(xiàn),蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白具有良好的治療類風濕關(guān)節(jié)炎作用[2-4],但其腥味重,化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,藥物作用時間短,制約了臨床推廣應(yīng)用。

        以殼聚糖-海藻酸鹽為囊材包埋蛋白是一種新型制藥技術(shù),它有助于保持蛋白類藥物的生物活性[5-6],提高膠囊穩(wěn)定性和載藥量,并可調(diào)節(jié)藥物釋放速度,實現(xiàn)緩釋性能,具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前,尚無制備蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白殼聚糖-海藻酸鹽納米膠囊的報道,故本實驗通過反相乳化法制備該制劑,正交試驗優(yōu)化其工藝,并對其理化性質(zhì)進行表征,藥物釋藥性能進行考察,從而為相關(guān)新型給藥系統(tǒng)的研發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

        1 材料

        Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析儀、Zeta 電位儀(英國Malvern 公司);H-7650 透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司);酶標儀(美國Thermo 公司);磁力攪拌器(德國IKA 公司)。海藻酸鈉、乙酸、氫氧化鈉、PBS 緩沖液,氯化鈣均為分析純(上海阿拉丁試劑有限公司);透析袋(截留分子量10 000)、殼聚糖(生物技術(shù)級,脫乙酰度≥95%)(上海麥克林生化科技有限公司);水為雙蒸水(美國Millipore 公司)。蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白[7](自制,含有量95%)。

        2 方法

        2.1 納米膠囊制備 100 mg 海藻酸碾碎,轉(zhuǎn)移到0.5%乙酸中溶解,加入Ⅱ型膠原蛋白凍干粉超聲溶解,再加入CaCl2溶液超聲乳化完全,緩慢滴加0.5 mol/L NaOH 將pH值調(diào)至7.5,得到海藻酸鈣Ⅱ型膠原蛋白納米膠囊,將其洗滌離心后加到殼聚糖溶液中磁力攪拌2 h,即得。

        2.2 透射電鏡觀察 將分散于去離子水的蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白納米膠囊滴于200 目噴碳銅網(wǎng)上,室溫干燥后滴加數(shù)微升2% 磷鎢酸鈉負染液,靜置后濾紙吸去負染液,干燥30 min后進行電鏡觀察。

        2.3 粒徑、Zeta 電位測定 應(yīng)用激光納米粒徑儀檢測粒徑、Zeta 電位,觀察粒徑分布范圍。

        2.4 載藥量、包封率、釋藥性能測定

        2.4.1 載藥量 精密稱取納米膠囊適量(C2)于研缽中研細,適量PBS 緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.2)混勻,待其充分溶脹后再劇烈攪拌30 min,使蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白充分溶出,濾液定容后采用羥脯氨酸法測定羥脯氨酸質(zhì)量濃度,乘以系數(shù)7.46 即為其含有量(C1),計算載藥量,公式為載藥量=C1/C2×100%。

        2.4.2 包封率 取納米膠囊約100 mg 于50 mL 量瓶中,PBS 緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.2)定容,待其充分溶脹后離心取上清液,羥脯氨酸法測定上清液蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白質(zhì)量(C3),沉淀置于研缽中研細,加適量PBS 緩沖液劇烈攪拌30 min,以使蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白充分溶出,羥脯氨酸法測定其質(zhì)量(C4),計算包封率,公式為包封率=[C4/(C4+C3)]×100%。

        2.4.3 釋藥性能 100 mg 海藻酸碾碎,轉(zhuǎn)移到150 mL 0.5%乙酸中,加入100 mg Ⅱ型膠原蛋白超聲乳化,得到微乳溶液,將它和納米膠囊置于含有人工胃液浸液的透析袋內(nèi),放入生理鹽水中,在不同時間點取樣,羥脯氨酸法測定蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白質(zhì)量濃度,計算藥物累積釋放率,同時加入等量新鮮人工胃液保持恒定體積。

        3 結(jié)果

        3.1 制備工藝優(yōu)化 因素水平見表1,結(jié)果見表2,方差分析見表3。

        表1 因素水平

        表2 試驗設(shè)計與結(jié)果

        表3 方差分析

        由表可知,蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白與海藻酸比例對粒徑、Zeta 電位影響最大,殼聚糖溶液濃度次之,CaCl2溶液濃度影響最?。蛔顑?yōu)工藝 為A3B2C3,即CaCl2溶液濃度20 mmol/L,蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白與海藻酸比例1∶1,殼聚糖溶液濃度1%。再進行3 批驗證試驗,測定平均粒徑為(210±5.12)nm,PDI 為0.16±0.03,Zeta 電位為(-25.46±0.56)mV,粒徑分布見圖1。

        圖1 蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白納米膠囊的粒徑分布

        3.2 微觀形態(tài) 圖2 顯示,納米膠囊大小均勻,分散性好,表面光滑飽滿。

        圖2 納米膠囊透射電鏡圖

        3.3 載藥量、包封率 納米膠囊平均包封率、載藥量分別為(83.69±4.31)%、(16.35±1.35)%。

        3.4 釋藥性能 圖3 顯示,納米膠囊24 h 累積釋放率為(81.86±3.15)%,實現(xiàn)了緩釋作用;蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白釋放的總體趨勢是先快后慢,12 h 時微乳釋放率不大于55%,而此時納米膠囊已達到95%。

        圖3 樣品釋藥性能曲線

        4 討論

        本實驗通過正交設(shè)計[8]獲得蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白納米膠囊最優(yōu)參數(shù),此時所得制劑性能優(yōu)良,具有良好的穩(wěn)定性和粒徑分布范圍,并且表面光滑飽滿,這是因為在形成過程中蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白首先被海藻酸表層富集,之后海藻酸中α-L-古羅糖醛酸單元與CaCl2中鈣離子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),逐步形成帶負電荷海藻酸鈣囊殼,它在帶正電荷的殼聚糖溶液中受靜電作用而進一步成型[9]。進一步研究發(fā)現(xiàn),該制劑具有的良好藥物包封性能,這是因為膠囊囊芯中蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白在海藻酸鈣與殼聚糖的共同包埋下,由于海藻酸與鈣離子交聯(lián)度反應(yīng)而使囊膜致密性增加,兩者一起形成致密的納米膠囊網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致它從基質(zhì)滲透到外界環(huán)境溶液的難度加大,避免了藥物泄漏損失,從而具有良好的包封率[10-11]。另外,還測得其平均載藥量大于15%,具有一定的臨床應(yīng)用價值。

        蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白緩釋納米膠囊具有良好的緩釋效果,這可能是由于海藻酸與蘄蛇Ⅱ型膠原蛋白之間受氫鍵與靜電作用,使得其結(jié)構(gòu)更致密,可抑制藥物擴散速率[12],從而實現(xiàn)了該作用。

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