王新立，劉汝銀，王西彬，岳宗進

（河南省中醫(yī)院脊柱外科，河南 鄭州 450000）

椎間盤退變性疾病是中老年人的常見病和多發(fā)病，被認為與椎間盤結(jié)構(gòu)的崩塌和功能失調(diào)有關［1］。髓核細胞為類軟骨細胞，是椎間盤髓核的主要細胞，能夠合成及分泌II 型膠原（collagen II）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）等功能性細胞外基質(zhì)，在維持椎間盤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、功能完整等方面起著關鍵性作用［1-2］。研究認為，椎間盤退變與髓核細胞數(shù)量減少及其細胞外基質(zhì)代謝失衡導致的細胞微環(huán)境改變密切相關［2-3］，但其具體分子機制尚未完全明確。牛膝提取物被證實具有促進軟骨細胞增殖、增加軟骨細胞collagen II 表達、恢復軟骨基質(zhì)成分、修復軟骨損傷的作用［4-6］。牛膝總皂苷（Achyranthes bidentatasaponins，ABS）作為傳統(tǒng)中藥牛膝的主要有效成分，也被證實能夠促進軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡，修復軟骨組織損傷［7-8］，但是否影響髓核細胞的存活及其細胞外基質(zhì)合成尚未見報道。本實驗以大鼠椎間盤髓核細胞為研究對象，體外建立氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模型模擬椎間盤髓核細胞退變微環(huán)境，探究ABS 對髓核細胞增殖、凋亡和細胞外基質(zhì)合成的影響，并探討其可能的作用機制，以期為相關發(fā)病機制及其治療方法的研究提供新思路和實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠（6 周齡，體質(zhì)量220～250 g），由河南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SYXK（豫）2015-0005。所有動物實驗均經(jīng)過河南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準文號Z1.0／513）。

1.2 試劑 DMEM 培養(yǎng)基（批號12800-017）、胎牛血清（FBS，批號16000-044）、胰酶（批號25200-056）、Ⅱ型膠原酶（批號C21901）均購于美國Gibco 公司。ABS 由本課題組提取制備，質(zhì)量分數(shù)約52%。沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關酶1（sirtuin1，SIRT1）抑制劑6-氯-2，3，4，9-四氫-1H-咔 唑-1-甲酰胺（6-chloro-2，3，4，9-tetrahydro-1H-carbazole 1-carboxamide，EX527，批號E7034）、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA，批號M9281）均購于美國Sigma 公司。CCK-8 細胞活性檢測試劑盒（批號C0038）、caspase-3 活性檢測試劑盒（批號C1115）、RIPA 裂解液（批號P0013）、BCA 蛋白檢測試劑盒（批號P0011）均購于上海碧云天生物科技有限公司。Annexin V-FITC／PI 凋亡檢測試劑盒（批號BD556547）購自美國BD 公司。TRIzol（批號80802）、MML-V逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號 K1622）均購于美國Invitrogen 公司。SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒（批號RR820A）購于寶生物工程（大連）有限公司。PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。Collagen II（批號sc-52658）、Aggrecan（批號sc-166951）抗體購于美國Santa Cruz 公司；SIRT1 抗體（批號 2493S）購于美國 Cell Signaling Technology 公司；ATG5（批號ab108327）、LC3（批號ab128025）、p62（批號ab109012）、β-actin（批號ab8226）抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購于英國Abcam 公司。

2 方法

2.1 大鼠椎間盤髓核細胞的分離與培養(yǎng) 采用1%戊巴比妥鈉麻醉SD 大鼠，無菌條件下分離其脊柱，收集腰椎間盤。解剖顯微鏡下分離椎間盤髓核組織，用含雙抗的PBS 清洗后剪碎，依次采用0.25% 胰酶和0.2%Ⅱ型膠原酶在37 ℃水浴中分別消化30 min、3 h。離心后收集細胞沉淀，重懸于含10% FBS 及1% 青霉素／鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3 d 換液1次。待細胞融合度約80% 左右，用0.25% 胰酶消化傳代，選取第3 代細胞進行實驗。為了選擇合適的作用濃度，向培養(yǎng)基中添加不同濃度（0、20、40、60、80 μg／mL）ABS，培養(yǎng)48 h 后CCK-8 試劑盒檢測細胞存活率。

2.2 氧糖剝奪模型及分組 采用體外OGD 模型，用于模擬髓核細胞退變微環(huán)境。將大鼠椎間盤髓核細胞分為對照組，采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠椎間盤髓核細胞；OGD 組，將細胞培養(yǎng)基更換為無血清無糖的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃低氧（5% CO2、1% O2、94% N2）條件下培養(yǎng)12 h；OGD ＋ABS組，向無血清無糖的 DMEM 培養(yǎng)基中添加40 μg／mLABS，再于37 ℃低氧中培養(yǎng)；OGD＋ABS＋EX527 組，向無血清無糖的DMEM 培養(yǎng)基中添加40 μg／mLABS、2 μmol／L SIRT1 抑制劑EX527，再于37 ℃低氧中培養(yǎng)；OGD＋ABS＋3-MA 組，向無血清無糖的DMEM 培養(yǎng)基中添加40 μg／mLABS、5 mmol／L 自噬抑制劑3-MA，再于37 ℃低氧中培養(yǎng)。

2.3 CCK-8 檢測細胞存活率 按照CCK-8 細胞存活率檢測試劑盒操作，檢測各組細胞存活率。將經(jīng)過不同處理的各組細胞以2×105／mL 濃度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h 后每孔加入20 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h，酶標儀檢測450 nm 處吸光度值（A450）。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 按照Annexin V-FITC／PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，檢測各組細胞凋亡。將經(jīng)過不同處理的各組細胞以3.5×105／mL濃度接種于6 孔板，用冷PBS 洗滌細胞2 次，加入500 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細胞。向細胞懸液中依次加入10 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，緩慢混勻，室溫避光孵育15 min，于1 h 內(nèi)在FACS Calibur 流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

2.5 caspase-3 試劑盒檢測caspase-3 活性 按照caspase-3 活性檢測試劑盒說明書操作，檢測各組細胞caspase-3 活性。收集經(jīng)過不同處理的各組細胞，冷PBS 洗滌細胞1 次，加入細胞裂解液，冰上裂解10 min，離心后收集上清。向96 孔板每孔分別加入10 μL 各組上清、10 μL caspase-3 底物、80 μL 反應緩沖液，混勻后37 ℃孵育2 h，酶標儀檢測405 nm 處吸光度值（A405）。

2.6 實時定量PCR 檢測collagen II和Aggrecan mBNA表達 收集經(jīng)過不同處理的各組細胞，Trizol 法提取細胞總RNA，用MML-V 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成模板cDNA。以β-actin 為內(nèi)參，利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒，按照說明書行實時定量PCR 檢測。引物序列如下：collagen II正向5′-GGAAGAGTGGAGACTACTGGATTGAC-3′，反向5′-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-3′；Aggrecan正向5′-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3′，反向 5′-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-3′；β-actin 正向5′-TCCTAGCACCATGAAGATC-3′，反向 5′-AAACGCAGCTCAGTAACAG-3′。按照2－△△Ct法計算各組細胞中目的基因的相對表達量。

2.7 Western blot 檢測collagen II、Aggrecan、SIRT1及自噬相關蛋白表達 收集經(jīng)過不同處理的各組細胞，RIPA 裂解，離心提取總蛋白，BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品采用10% SDS-PAGE進行分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，漂洗后分別與抗collagen II（1∶800）、Aggrecan（1∶1 000）、SIRT1（1∶1 000）、ATG5（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）、p62（1∶10 000）、β-actin（1∶1 000）等抗體4 ℃孵育過夜，漂洗后與辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，漂洗后加入發(fā)光液顯影。用Image J 軟件分析條帶灰度，以目標蛋白與內(nèi)參β-actin 灰度值的比值作為目標蛋白的相對表達水平。

2.8 統(tǒng)計學分析 用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，采用組間單因素方差分析及LSD-t 檢驗進行兩兩比較，所有實驗均重復3 次，數(shù)據(jù)以（±s）表示。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 ABS 對髓核細胞存活率的影響 如圖1 所示，ABS 質(zhì)量濃度為20～40 μg／mL時，大鼠椎間盤髓核細胞存活率逐漸升高，在40 μg／mL 時最強（P＜0.01），而ABS 質(zhì)量濃度60～80 μg／mL 時細胞存活率逐漸降低，表明低質(zhì)量濃度下能促進大鼠椎間盤髓核細胞的存活率。

圖1 不同質(zhì)量濃度ABS 對髓核細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of ABS on the survival rate of nucleus pulposus cells

3.2 ABS 抑制OGD 誘導的髓核細胞凋亡 如圖2所示，與對照組比較，OGD 組細胞存活率降低（P＜0.05），細胞凋亡 率、caspase-3 活性升高（P＜0.05）；加入ABS 干預后，與OGD 組比較細胞存活率升高（P＜0.05），細胞凋亡、caspase-3 活性降低（P＜0.05），表明ABS 可減少退變微環(huán)境中髓核細胞的凋亡。

3.3 ABS 對OGD 誘導的髓核細胞胞外基質(zhì)的影響 如圖3 所示，與對照組比較，OGD 組細胞collagen II、AggrecanmRNA 和蛋白表達水平均下調(diào)（P＜0.05），表明OGD 模擬的退變微環(huán)境下，髓核細胞胞外基質(zhì)collagen II、Aggrecan 表達減少；與OGD 組比較，OGD＋ABS 組collagen II、AggrecanmRNA 和蛋白表達水平均上調(diào)（P＜0.05），表明ABS 可抑制退變微環(huán)境中髓核細胞的胞外基質(zhì)減少。

圖2 ABS 對OGD 誘導的髓核細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of ABS on OGD-induced apoptosis of nucleus pulposus cells

圖3 ABS 對OGD 誘導的髓核細胞胞外基質(zhì)的影響Fig.3 Effects of ABS on OGD-induced extracellular matrix of nucleus pulposus cells

3.4 ABS 激活SIRT1／自噬信號通路促進髓核細胞存活和細胞外基質(zhì)合成 SIRT1 和自噬相關信號通路被證實與退變髓核細胞的存活及其胞外基質(zhì)合成密切相關［2，9］。如圖4 所示，與對照組比較，OGD組SIRT1、ATG5 和LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表達均減少，p62 蛋白表達增加（P＜0.05）；與OGD 組比較，OGD＋ABS 組SIRT1、ATG5 和LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的蛋白表達均增加，p62 蛋白表達減少（P＜0.05），表明在OGD 模擬的退變微環(huán)境下，ABS 處理激活了SIRT1／自噬信號通路。與OGD ＋ABS 組比較，OGD＋ABS＋EX527 組和OGD＋ABS＋3-MA 組的細胞存活率下調(diào)（P＜0.05），細胞凋亡率上調(diào)（P＜0.05），collagen II、Aggrecan 蛋白表達水平均下調(diào)（P＜0.05），表明抑制SIRT1／自噬信號通路可抑制ABS 誘導的髓核細胞存活和細胞外基質(zhì)合成。

圖4 ABS 激活SIRT1／自噬信號通路對髓核細胞存活和胞外基質(zhì)合成的影響Fig.4 Effects of ABS-activated SIRT1／autophagy signaling pathway on the survival of nucleus pulposus cells and extracellular matrix synthesis

4 討論

髓核退變，包括髓核細胞數(shù)量的減少及其胞外基質(zhì)減少引起的髓核功能障礙，被認為是椎間盤退變的主要因素［2-3］，因此，促進髓核細胞的存活，增加髓核細胞胞外基質(zhì)合成，或減少其胞外基質(zhì)降解對于抑制椎間盤退變進程具有重要意義。研究表明，ABS 能夠促進軟骨細胞增殖，抑制軟骨細胞凋亡［7-8］，但其是否影響類軟骨細胞-髓核細胞的存活及胞外基質(zhì)代謝尚不明確。因此，本研究首先采用不同ABS 體外干預大鼠椎間盤髓核細胞，發(fā)現(xiàn)低濃度下能夠促進大鼠髓核細胞的增殖，提示它可影響髓核細胞的存活。為了進一步探究ABS 是否影響退變微環(huán)境中髓核細胞的存活，本研究采用OGD 模型體外模擬髓核細胞退變微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)ABS 處理后可使處于OGD 環(huán)境中的髓核細胞的增殖顯著增加、凋亡顯著減少，細胞caspase-3 活性顯著降低，提示它可促進退變微環(huán)境中髓核細胞的存活。

椎間盤退變往往伴隨著髓核細胞胞外基質(zhì)的減少，使得髓核組織結(jié)構(gòu)不穩(wěn)，髓核細胞功能發(fā)生障礙，從而增加髓核細胞基質(zhì)合成、分泌，或者減少其基質(zhì)降解，能有效延緩椎間盤退變進程［3，10］。既往研究表明，牛膝提取物能增加軟骨細胞collagen II 表達并恢復軟骨基質(zhì)成分［4，6］；本研究發(fā)現(xiàn)，ABS 后處理可使處于OGD 環(huán)境中的髓核細胞的主要細胞外基質(zhì)collagen II、AggrecanmRNA 和蛋白表達均顯著增加，提示ABS 可促進退變微環(huán)境中髓核細胞的胞外基質(zhì)合成與分泌。

SIRT1 能夠調(diào)控細胞的多種生命活動，已被證實可以調(diào)控軟骨細胞的分化，代謝以及抗應激能力，并且影響軟骨細胞的增殖、凋亡、自噬、胞外基質(zhì)表達［11］。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 和自噬相關信號通路可以調(diào)控退變髓核細胞的存活和胞外基質(zhì)合成［2，9］，多種中藥有效成分可通過調(diào)控兩者來影響髓核細胞的存活及胞外基質(zhì)合成［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，ABS 處理可顯著上調(diào)OGD 環(huán)境中髓核細胞SIRT1、ATG5、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ蛋白表達，下調(diào)p62蛋白表達，提示ABS 可激活退變微環(huán)境中髓核細胞的SIRT1／自噬信號通路。此外，SIRT1 抑制劑EX527 或自噬抑制劑3-MA 的干預可顯著抑制OGD環(huán)境中ABS 介導的髓核細胞增殖增加、凋亡減少、collagen II 和Aggrecan 蛋白表達上調(diào)，提示ABS 可能通過激活SIRT1／自噬信號通路促進大鼠椎間盤髓核細胞存活和細胞外基質(zhì)合成。

綜上所述，ABS 可通過激活SIRT1／自噬信號通路促進退變髓核細胞的存活及其胞外基質(zhì)表達，進而抑制椎間盤髓核退變。本研究為椎間盤退變性疾病的治療提供了新方向，也為ABS 在椎間盤退變性疾病的防治應用提供了實驗依據(jù)。