赫一鳴，劉 鑫，王玥玥，曹 雪，貢濟(jì)宇，蔡廣知

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

車前子為車前科植物車前Plantago asiaticaL.或平車前Plantago depressaWilld.的干燥成熟種子［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［2］，其味甘，具有清熱利尿通淋、滲濕止渴、明目、祛痰的功效，用于熱淋濕痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽等癥狀的治療［3-4］。炒車前子為車前子清炒后的炮制品，對(duì)便秘具有良好療效［5］，并可增強(qiáng)生品清熱利尿、腎濕通淋的作用［6］。

2015 年版《中國藥典》一部收載了腎炎解熱片、八正合劑、金花明目丸、除濕白帶丸、益腎靈顆粒等含有炒車前子的中成藥，廣東、河南、上海等地在炮制規(guī)范中以車前子為炒車前子質(zhì)控指標(biāo)，不能體現(xiàn)該藥材炒制前后各項(xiàng)指標(biāo)的變化。因此，本實(shí)驗(yàn)參考藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，采用TLC、HPLC 法分別對(duì)炒車前子中主要活性成分京尼平苷酸和毛蕊花糖苷進(jìn)行定性鑒別、定量分析，從性狀、鑒別、檢查方面進(jìn)行系統(tǒng)研究［7］，以期更好地控制該藥材質(zhì)量，保證臨床療效［8］。

1 材料

DGG-9030 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；電子天平（萬分之一、十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；HH-S24數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市榮華儀器制造有限公司）；LC-2030 高效液相色譜儀（日本島津公司）。京尼平苷酸（批號(hào)111828-201604）、毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201713）對(duì)照品購于中國食品藥品檢定研究院。10 批車前子購于宏檢大藥房等地，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與鑒定教研組蔡廣知副教授鑒定為正品，具體見表1。甲醇為色譜純（美國Fisher 公司；水為屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 炒制品制備［9］取適量凈藥材于炒制容器中，用文火炒至略有爆聲、有香氣溢出時(shí)取出，晾涼，即得。

2.2 性狀特征 本品呈橢圓形、不規(guī)則長圓形或三角狀長圓形，略扁［7］；一面有灰白色凹點(diǎn)狀種臍，長（2±0.5）mm，寬（1±0.3）mm，表面有細(xì)皺紋，顯黃棕色至黑褐色［1］；質(zhì)硬，氣焦香。

2.3 TLC 定性鑒別

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取毛蕊花糖苷、京尼平苷酸對(duì)照品各1 mg，甲醇制成1 mg／mL，即得［1］。

2.3.2 供試品溶液制備 取本品粗粉1 g，10 mL甲醇超聲30 min，濾過，蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解，即得［1］。

2.3.3 鑒別方法 采用2015 年版《中國藥典》薄層色譜法（通則0502）。吸取對(duì)照品、供試品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（18∶2∶1.5∶1）為展開劑，置于254 nm 紫外燈下觀察，發(fā)現(xiàn)供試品色譜在對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)［1］；以0.5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰可見，也發(fā)現(xiàn)上述情況［9-10］。見圖1。

圖1 炒車前子TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatograms of Plantaginis Semen Tostum

2.4 檢查

2.4.1 水分、總灰分、酸不溶性灰分 采用2015年版《中國藥典》四部方法測定［11］，結(jié)果見表2。

表2 水分、總灰分、酸不溶性灰分、膨脹度測定結(jié)果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of water，total ash，acid-insoluble ash and turgidity（n＝3）

2.4.2 膨脹度 稱取本品1 g，采用2015 年版《中國藥典》膨脹度測定法（通則2101）測定［1］，結(jié)果見表2。以水分、總灰分、酸不溶性灰分平均含有量的120%，膨脹度的80%制定限度，暫定前三者分別不超過0.032%、5.2%、0.52%，后者不低于3.9［12］。

2.5 含有量測定

2.5.1 對(duì)照品溶液制備［1］精密稱取毛蕊花糖苷、京尼平苷酸對(duì)照品適量，置于棕色量瓶中，60%甲醇制成1 mg／mL，即得。

2.5.2 供試品溶液制備［1］取本品粉末（過2 號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h 后放冷，60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 色譜條件［1］Hypersil ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-［醋酸-水（0.5∶100）］（B），梯度洗脫（0～1 min，5% A；1～40 min，5%～60% A；40～50 min，60%～5% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖2。由此可知，色譜峰分離度良好，陰性無干擾，理論塔板數(shù)按京尼平苷酸峰計(jì)不低于3 000。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC charomatograms of various constituents

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察［13］分別精密吸取含0.016、0.032、0.063、0.127、0.254、0.508 mg／mL 京尼平苷酸，0.016、0.032、0.065、0.130、0.260、0.520 mg／mL 毛蕊花糖苷的對(duì)照品溶液，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷方程分別為Y＝6 891 949.924X－15 839.402 99（r＝0.999 3）、Y＝6 621 703.133X－28 736.930 35（r＝0.999 5），分別在0.793 75～25.400、0.812 5～26.00 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗(yàn)［14-15］精密吸取同一供試品溶液10 μL，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得供試品溶液峰面積RSD 為1.6%，表明儀器精密度良好［15］。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)［16］精密吸取同一對(duì)照品、供試品溶液各10 μL，于0、2、4、6、8、10、12 h在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得對(duì)照品、供試品溶液峰面積RSD 分別為2.8%、2.1%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品（批號(hào)180921），按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含有量RSD 分別為0.24%、0.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的本品6 份，精密加入適量對(duì)照品，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷平均加樣回收率分別為99.5%、99.8%，RSD 分別為1.2%、2.5%。

2.7 樣品含有量測定 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品（炒制前、炒制后）溶液，在“2.5.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。根據(jù)測定結(jié)果，結(jié)合2015 年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定，暫定京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含有量分別不少于0.90%、0.55%。

表3 各成分含有量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of various constituents

3 討論

車前子炒制后，京尼平苷酸含有量較生品升高35%，而毛蕊花糖苷升高38%，可能是炒制會(huì)破壞藥材中大量黏液質(zhì)，使有效成分易煎出［17］，具體有待進(jìn)一步研究。另外，由于炒制后車前子種皮內(nèi)表皮、外表皮細(xì)胞被破壞，內(nèi)胚乳細(xì)胞蛋白質(zhì)變性，故不將顯微鑒別列入該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

炒車前子作為常用藥材，目前尚無明確的炮制規(guī)范和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)所建立的炒車前子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可操作性強(qiáng)，能指導(dǎo)炮制品規(guī)范化生產(chǎn)，為保證其臨床療效提供依據(jù)，也對(duì)監(jiān)督相關(guān)藥物質(zhì)量有著重要意義。