何 艷，胡小祥

（1.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000； 2.郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 郴州 423000）

杜仲平壓片是由杜仲葉經(jīng)水煎、濃縮所得浸膏加工制成的片劑，功效降血壓、強(qiáng)筋健骨，適用于高血壓、腰膝酸痛、筋骨痿軟等癥，臨床用于治療高血壓和骨質(zhì)疏松。杜仲葉有效物質(zhì)主要包括綠原酸、咖啡酸等苯丙素類成分［1-2］，京尼平苷酸、京尼平苷等環(huán)烯醚萜類成分［3］，以及蘆丁、槲皮素等黃酮類成分［4］，其中綠原酸具有利膽、抗菌、抗病毒、降壓等多種藥理作用［5-6］；咖啡酸對(duì)心臟和血管組織增生有明顯抑制作用，可降低血漿中內(nèi)皮素水平，對(duì)內(nèi)皮素-1 引起的血壓上升具有明顯拮抗作用，從而降低血壓［7］；京尼平苷酸能增殖造骨細(xì)胞，抗骨質(zhì)疏松，降低血壓［8］；蘆丁具有廣泛的生物活性，如降血壓、降血脂、抗氧化、舒張血管等［9-10］。

然而，現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)杜仲平壓片中綠原酸進(jìn)行定性鑒別和定量測(cè)定［11-12］，尚未涉及其他活性成分，并且相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也較少［13］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定杜仲平壓片中京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁的含有量，以期為進(jìn)一步完善該制劑質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置G1311B 四元泵、G1329B 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A 柱溫箱、G1315D DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent Technologies 公司）；XSE-205 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸（批號(hào)110753-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）、京尼平苷酸（批號(hào)111828-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 97.4%）、咖啡酸（批號(hào)110885-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、蘆?。ㄅ?hào)100080-201811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.4%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號(hào)18031001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.67%）、隱綠原酸（批號(hào)18032403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.07%）對(duì)照品均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。杜仲平壓片（批號(hào)171510，西安阿房宮藥業(yè)股份有限公司；批號(hào)20171101、20170603、20180102，貴州三仁堂藥業(yè)有限公司）。乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；磷酸、甲醇為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo Hypersil Gold-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，5%～10%A；15～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%A；30～35 min，16%～30%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm（0～10 min）、324 nm（10～25 min）、354 nm（25～35 min）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品京尼平苷酸9.59 mg、新綠原酸10.34 mg、綠原酸15.28 mg、隱綠原酸10.56 mg、咖啡酸6.04 mg、蘆 丁5.49 mg，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取3、5、6、7、1、2 mL，置于同一25 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（含京尼平苷酸22.42 μg／mL、新綠原酸41.22 μg／mL、綠原酸72.83 μg／mL、隱綠原酸58.58 μg／mL、咖啡酸4.817 μg／mL、蘆丁8.116 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取片劑適量，除去薄膜衣或糖衣，研細(xì)，取粉末約0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（300 W、40 kHz）30 min，放冷，50% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，濾液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按片劑處方工藝制得只含輔料的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分分離效果理想（分離度均大于1.5），陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、6、10、14 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定積。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁峰面積RSD 分別為0.14%、0.21%、0.23%、0.20%、0.25%、0.29%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)171510），于0、4、8、12、16、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁峰面積RSD 分別為1.42%、0.29%、0.30%、0.36%、0.70%、1.57%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號(hào)171510）片劑6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁含有量RSD 分別為1.32%、0.86%、0.97、1.50%、0.89%、1.14%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的同一批（批號(hào)171510）片劑，除去薄膜衣或糖衣，研細(xì)，精密稱取粉末約0.25 g，共6 份，置于錐形瓶中，精密加入50 mL 含京尼平苷酸（8.756 μg／mL）、新綠原酸（20.61 μg／mL）、綠原酸（30.37 μg／mL）、隱綠原酸（33.43 μg／mL）、咖啡酸（0.682 9 μg／mL）、蘆?。?.490 μg／mL）的50% 甲醇，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁平均加樣回收率分別為99.51%、100.10%、100.34%、99.26%、99.01%、98.07%，RSD 分別為1.85%、1.19%、1.26%、1.96%、1.30%、1.03%。

2.9 樣品含有量測(cè)定 取4 批片劑，每批3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)篩選 本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測(cè)器在200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并采集光譜圖。結(jié)果，京尼平苷酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、蘆丁分別在238、326、326、326、324、354 nm 處有最大吸收，綜合考慮各成分在供試品色譜圖中的響應(yīng)值，最終選擇238 nm作為京尼平苷酸檢測(cè)波長(zhǎng)，324 nm 作為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸檢測(cè)波長(zhǎng)，354 nm 作為蘆丁檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Sunfire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo Hypersil Gold-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)Thermo Hypersil Gold-C18色譜柱分離效果最好，色譜峰對(duì)稱性理想。再考察了流動(dòng)相乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.5% 磷酸［14-15］，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.5%磷酸洗脫時(shí)各成分均達(dá)到較好的分離，而且兩者效果基本一致，綜合考慮成本和安全因素，選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相。

3.3 提取方法篩選 本實(shí)驗(yàn)比較了提取溶劑乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇，發(fā)現(xiàn)50%甲醇提取時(shí)各成分提取率最高，色譜峰峰形最好，故選擇其作為提取溶劑。再考察了超聲時(shí)間20、30、40、50 min，發(fā)現(xiàn)超聲30 min 時(shí)各成分提取基本完全，故確定其作為提取時(shí)間。

3.4 含有量分析 表3 顯示，4 批杜仲平壓片中各成分含有量差異較大，以京尼平苷酸最明顯，其原因可能是不同批次原料藥的差異所致，故生產(chǎn)廠家應(yīng)對(duì)此加以關(guān)注。