錢佳燕，黃子慧，陳 肯，余 洋，朱思洵，高璐玨，高敏行

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014）

肺外結(jié)核是指發(fā)生在肺部以外全身其他臟器的結(jié)核?。?-3］，當(dāng)結(jié)核分支桿菌［4］經(jīng)各種傳播路徑侵犯機體局部組織時，可引起病灶周圍軟組織、皮下、皮膚壞死，最終液化破潰而形成結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面，是世界上首要感染性疾?。?］，約占肺外結(jié)核一半以上［4-5］。有學(xué)者臨床觀察發(fā)現(xiàn)［6］，由于潰瘍周圍血供破壞，全身抗癆藥物難以使局部組織中藥物達到有效殺菌濃度，導(dǎo)致整體療效較差，故急需能顯著促進結(jié)核型創(chuàng)面愈合的外用藥物。

南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院瘰疬科基于結(jié)核性潰瘍的病機特點，研制了復(fù)方五鳳草液，方中五鳳草［7］又名澤漆，性味辛、苦、涼，具有行水殺蟲、祛腐解毒之功效，其主要活性成分沒食子酸、原兒茶酸、金絲桃苷、柚皮素等有抗菌、抗炎、抗氧化作用［8-10］，能抑制結(jié)核桿菌的生長；白芨［11］性味苦、甘、涼，含有大量黏膠質(zhì)，具有收斂止血、清熱濕、消腫生肌之功效，其成分沒食子酸、原兒茶酸、肉桂酸等具有抗耐藥結(jié)核活性［12-13］，對人型結(jié)核桿菌有抑制作用，并能提高傷口巨噬細胞數(shù)量，對組織愈合有保護作用；貓爪草［14］性味甘、辛、溫，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，其煎劑、生藥粉末、醇提液在試管內(nèi)對強毒人型結(jié)核菌（H37RV）均有不同程度的抑制作用，而且強于異煙肼，其所含對羥基苯甲酸、咖啡酸等具有抑制細菌、真菌和酶作用［12-13］，諸藥共奏提膿祛腐、活血生肌之效，并取得了滿意的療效［15-16］。

目前，對復(fù)方五鳳草液中各成分含有量測定仍是空白。因此，本實驗采用UPLC-PDA 法同時測定復(fù)方五鳳草液中沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素的含有量，可為進一步提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，同時也能促進治療結(jié)核性潰瘍外用藥物的研發(fā)。

1 材料

1.1 儀器 Waters AcquityTMUPLC 系統(tǒng)［配置四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機、自動進樣器、Mass Lynx4.1 質(zhì)譜工作站軟件，沃特世科技（上海）有限公司］；Milli-Q 超純水系統(tǒng)［Millipore 實驗室設(shè)備（上海）有限公司］；MX-S 型旋渦混勻器（美國Scilogex 公司）；臺式高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；BSA2202S 型天平［十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；KH-500D 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 6 批復(fù)方五鳳草液（院協(xié)編號20181026，R1～R6）購自南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥房，五鳳草、貓爪草、白芨按25∶3∶5 比例配伍，加水浸沒過藥面煎煮3 次，每次1 h，合并煎液，濾 過，濾液濃縮，分 裝，即 得（生藥量1.76 g／mL）。沒食子酸（Y19M8C36143）、對羥基苯甲酸（MKBK3 576 V）對照品購自上海源葉生物科技有限公司；原兒茶酸（MUST-17022102）、咖啡酸（MUST-16060613）、金絲桃苷（MUST-17101605）、槲皮素（MUST-17101104）、柚皮素（MUST-17030406）對照品購自成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（上海安譜實驗科技股份有限公司）；水為超純水（Milli-Q 純水機制備）。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～3 min，6%A；3～7 min，6%～25% A；7～13 min，25%～50% A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫40 ℃；樣品盤溫度10 ℃；二極管陣列檢測器，檢測波長266 nm；進樣量2 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取適量沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素對照品于5 mL 量瓶中，甲醇分別溶解定容至8.490、1.082、1.286、0.956、0.988、0.978、1.010 g／L，吸取適量，甲醇稀釋成每1 mL分別 含602.08、60.59、13.18、95.60、167.96、13.69、10.48 μg 上述成分，即得。

2.3 供試品溶液制備 取0.5 mL 本品于10 mL 量瓶中，80% 甲醇稀釋定容，超聲（40 Hz）提取30 min，渦旋5 min 后13 000 r／min 離心10 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察 吸取“2.1”項下對照品、供試品溶液各2 μL，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分峰形良好，無干擾現(xiàn)象，表明該方法專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下對照品溶液，按甲醇與混標(biāo)1∶1 比例梯度稀釋7 次，每次稀釋后均渦旋混勻3 min，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取中間質(zhì)量濃度對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素峰面積RSD 分別為1.00%、0.77%、0.45%、0.31%、0.49%、0.74%、0.41%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液適量，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素峰面積RSD 分別為 0.45%、0.29%、1.10%、3.74%、0.25%、0.93%、0.59%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.5 重復(fù)性試驗 取同一批供試品溶液（R3）6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素峰面積RSD 分別為0.97%、2.74%、2.80%、4.20%、1.94%、1.53%、0.50%，表 明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取供試品溶液（R3）6份，每份0.5 mL，加入0.5 mL 對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，渦旋3 min 混勻，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素平均加樣回收率分別為99.30%、99.90%、99.78%、99.99%、99.86%、102.27%、96.96%。RSD 分別為1.04%、1.13%、0.72%、1.36%、0.65%、2.10%、1.16%。2.5 樣品含有量測定 取本品6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of various constituents

3 討論

3.1 提取溶劑篩選 本實驗考察了溶劑水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇的提取效果，發(fā)現(xiàn)水、甲醇提取時供試品溶解度相對較低，各成分出峰效果不理想，而50%、80%甲醇均能提取出各成分。綜合考慮各成分峰面積，最終確定80% 甲醇作為提取溶劑。

3.2 色譜條件篩選 本實驗采用二極管陣列檢測器對檢測波長進行考察，發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸吸收波譜較窄，僅有1 個最大吸收波長254 nm；咖啡酸最大吸收波長在324 nm 處，在統(tǒng)一波長下觀察時其峰形較差，故各成分峰面積均為其最大吸收波長下的數(shù)值。然后，考察了流動相乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1% 甲酸對色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸洗脫時各成分分離度、峰形在短時間內(nèi)最佳，響應(yīng)值最高，故選擇其作為流動相。

4 結(jié)論

2015 年版《中國藥典》僅記載了復(fù)方五鳳草液中白及、貓爪草的TLC 定性鑒別方法，未涉及澤漆和成分定量檢測［17］。本實驗首次建立快速方便的UPLC-PDA 法同時測定復(fù)方五鳳草液中沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、金絲桃苷、槲皮素、柚皮素的含有量，為該制劑質(zhì)量控制提供了依據(jù)，也為后期研究促進結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面愈合有效成分的作用機制及開發(fā)相關(guān)新藥奠定了基礎(chǔ)。