胡巍巍，王 茜，韓 雪，劉晨旭

（1.石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北 石家莊 050051； 2.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200）

小兒泄瀉停顆粒由羌活、車前子、蒼術(shù)、大黃、制大黃、甘草、制川烏7 味藥材加工而成，具有健脾化濕、消積止瀉的作用，主要用于嬰幼兒腹瀉的治療，尤其對小兒脾虛濕蘊(yùn)食津所引起的大便蛋花湯樣或糊狀，夾有粘液泡沫、乳塊，反復(fù)遷延不愈的嬰幼兒腹瀉效果最佳［1-6］。但該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［7］及袁藹芝等［8］僅對大黃所含成分大黃酸含有量進(jìn)行測定，未檢索到多成分同時(shí)定量測定的報(bào)道。

小兒泄瀉停顆粒中羌活祛風(fēng)勝濕，升陽補(bǔ)脾，含有揮發(fā)油、香豆素、有機(jī)酸等化合物，其中紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素為主要成分［9］；車前子利水滲濕止瀉，利小便，實(shí)大便，含有環(huán)烯醚萜、苯乙醇苷、三萜、多糖、苯丙素苷、黃酮類化合物，其中京尼平苷酸為其環(huán)烯醚萜類代表性成分，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為其苯乙醇苷類代表性成分［10-11］；蒼術(shù)健脾燥濕，含有聚乙烯炔、倍半萜、倍半萜苷成分，其中蒼術(shù)素醇、蒼術(shù)素為其聚乙烯炔類主要成分，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?yàn)槠浔栋胼祁愔饕煞郑?2-13］；大黃清利濕熱，消積導(dǎo)滯，制川烏溫中祛寒，甘草調(diào)和胃氣，諸藥合用，共奏健脾化濕、消積止瀉之效。因此，本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC 法同時(shí)測定小兒泄瀉停顆粒中紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素的含有量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和完善提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

Waters 2695 型高效液相色譜儀，配置Waters可變波長檢測器、Empower 工作站（美國Waters公司）；BP211D 型電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-250E 型超聲波清洗器（上海量壹科學(xué)儀器有限公司）。紫花前胡苷（111821-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、羌活醇（111820-201705，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、異歐前胡素（110827-201812，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、京尼平苷酸（111828-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.4%）、毛蕊花糖苷（111530-201713，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.5%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（111976-201501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、蒼術(shù)素（111924-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；異毛蕊花糖苷（61303-13-7，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）對照品購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；蒼術(shù)素醇（61642-89-5，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）對照品購自貴州迪大科技有限責(zé)任公司。小兒泄瀉停顆粒（每袋裝2 g，批號1807216、1809104、1809158）購自杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素2.912、0.674、4.730、1.318、0.896、0.492、0.216、0.958、2.194 mg 的貯備液，各精密吸取2.5 mL于50 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得。

2.2 供試品溶液制備 取顆粒適量，研細(xì)，精密稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備 按顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下處方及工藝，分別制備缺羌活、缺車前子、缺蒼術(shù)的陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 色譜條件 Kromasil Eternity C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.5%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～15.0 min，18.0% A；15.0～28.0 min，18.0%～35.0% A；28.0～46.0 min，35.0%～42.0% A；46.0～64.0 min，42.0%～49.0%A；64.0～75.0 min，49.0%～18.0%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；0～28.0 min 在315 nm［9］波長處檢測紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素，28.0～46.0 min 在254 nm［10］波長處檢測京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷，46.0～75.0 min 在270 nm［13］波長處檢測蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素；進(jìn)樣量10 μL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按均不低于3 500，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”項(xiàng)下貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置 于20 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到不同質(zhì)量濃度對照品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號1807216），在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素峰面積 RSD 分別為0.59%、0.81%、1.52%、0.75%、1.34%、0.59%、0.96%、1.85%、0.62%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同1 批顆粒（批號1807216）適量，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素含有量RSD 分別為1.42%、0.59%、1.33%、1.75%、0.48%、1.63%、1.91%、0.61%、1.24%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同1 批供試品溶液（批號1807216），室溫下于0、1、2、4、8、16 h 在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素峰面積RSD 分別為0.57%、0.86%、1.54%、0.77%、0.33%、0.96%、0.45%、1.83%、0.59%，表 明溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的顆粒9 份，每份1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入對照品溶液（含2.016 mg／mL 紫花前胡苷、0.502 mg／mL 羌活醇、3.494 mg／mL 異歐前胡素、0.858 mg／mL 京尼平苷酸、0.606 mg／mL 毛蕊花糖苷、0.332 mg／mL 異毛蕊花糖苷、0.118 mg／mL 蒼術(shù)素醇、0.654 mg／mL 白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、1.452 mg／mL蒼術(shù)素）0.5、1.0、1.5 mL，各3 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素平均加樣回收率分別為99.12%、98.26%、99.85%、98.79%、98.05%、97.99%、96.98%、98.74%、99.01%，RSD 分別為 0.90%、1.19%、0.87%、1.17%、1.06%、0.97%、1.57%、1.34%、0.94%。

2.6 樣品含有量測定 取3 批顆粒適量，研細(xì)，精密稱取2.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 流動(dòng)相篩選 參照2015 年版《中國藥典》一部中羌活、車前子、蒼術(shù)含有量測定條件，本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相乙腈-水［14-15］、甲醇-0.5%醋酸［10］、甲醇-水［16］，發(fā)現(xiàn)各成分色譜峰峰形均存在一定缺陷，故又采用乙腈-0.5%醋酸梯度洗脫［9，17］，同時(shí)其比例進(jìn)行摸索，最終確定為“2.4”項(xiàng)下條件，此時(shí)各成分色譜峰峰形較好，而且與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均能達(dá)到要求。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3.2 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)考察以甲醇［9，13-16，18］、60%甲醇［10，17，19］、稀乙醇為溶劑超聲30 min 的提取效果，發(fā)現(xiàn)用甲醇提取時(shí)不僅各成分綜合提取率最佳，而且峰形良好，雜質(zhì)無干擾，故選擇其作為提取溶劑。再考察超聲提取［9，13-16］、加熱回流提取［10］、室溫浸漬過夜提取的效果，發(fā)現(xiàn)加熱回流提取率略高于超聲，但雜質(zhì)明顯更多，而室溫浸漬過夜時(shí)提取率最低，故選擇超聲作為提取方法。最后，考察超聲時(shí)間15、30、45 min，發(fā)現(xiàn)提取30、45 min 時(shí)提取率相差不大，但均明顯優(yōu)于提取15 min 時(shí)，故最終確定供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次建立HPLC 法同時(shí)測定小兒泄瀉停顆粒中紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、蒼術(shù)素醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素的含有量，該方法簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)對該制劑更全面的質(zhì)量控制，也為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供依據(jù)。