申識(shí)川 王文芳 張玉紅

1.河南省濮陽(yáng)市檢驗(yàn)檢疫服務(wù)中心，河南濮陽(yáng)457000；2.河南省濮陽(yáng)市河道管理處，河南濮陽(yáng)457000；3.河南省濮陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南濮陽(yáng)457000

兔病毒性出血癥俗稱“兔瘟”、兔出血熱，是家兔及野兔的一種烈性、高致死性傳染病，由兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起，主要臨床癥狀表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死及實(shí)質(zhì)臟器水腫、淤血及出血性病變，以接觸傳播為主要傳播方式。該病發(fā)病急、發(fā)病率和病死率較高，被我國(guó)獸醫(yī)衛(wèi)生行政部門列為必須檢疫的二類傳染病。

1 兔出血癥病毒概述

兔出血癥病毒在病毒學(xué)分類上屬嵌杯病毒科兔病毒屬成員，表面無(wú)囊膜，直徑約40 nm，核衣殼呈20 面體對(duì)稱，和其他病毒結(jié)構(gòu)一樣，由病毒基因組和180 個(gè)衣殼蛋白亞單位聚合而成[1]。病毒基因組為單股正鏈RNA，整個(gè)基因組包括7 437 個(gè)核苷酸堿基，基因組5’末端沒(méi)有帽子結(jié)構(gòu)，3’末端有一個(gè)短的多聚腺嘌呤尾，編碼2 個(gè)開放閱讀框ORF1和ORF2，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。RHDV包括有血凝性和無(wú)血凝性2 種，目前在我國(guó)這2 種毒株均存在。

2 VP60 蛋白基因及結(jié)構(gòu)

VP60 蛋白基因?qū)儆诘? 個(gè)開放閱讀框的一部分，第1 個(gè)開放閱讀框位于病毒基因組5’的末端，從第10 個(gè)核苷酸堿基開始延伸至第7 041 個(gè)核苷酸堿基，編碼1 個(gè)多聚蛋白前體，其中VP60 基因全長(zhǎng)包括1 740 個(gè)核苷酸堿基。

研究表明，RHDV 的VP60 蛋白由多聚蛋白前體經(jīng)蛋白酶裂解而成，包括579 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為60 ku，故名VP60 蛋白[2]，其結(jié)構(gòu)主要分為3個(gè)區(qū)域，NTA（氨基端1～65aa）、S 區(qū)（66～229aa）和P區(qū)（238～579aa），第230～237aa 是S 區(qū)和P 區(qū)連接處存在的一段短的鉸鏈區(qū)。P 區(qū)主要由P1 亞區(qū)和P2亞區(qū)組成，P2 亞區(qū)位于RHDV 衣殼蛋白表面，含有病毒株特異性抗原表位和紅細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)[3]。

3 VP60 蛋白表達(dá)

VP60 蛋白是機(jī)體主要保護(hù)性抗原，為了進(jìn)一步搞清楚VP60 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，目前國(guó)內(nèi)學(xué)者構(gòu)建了多個(gè)VP60 蛋白表達(dá)系統(tǒng)，主要包括原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。

3.1 原核表達(dá)系統(tǒng)

原核表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)，技術(shù)成熟，表達(dá)量高、周期短，是早期研究VP60 蛋白的首選，也是應(yīng)用最廣的表達(dá)系統(tǒng)。

安凱等[4]克隆了RHDV GS/YZ 株的VP60 截短基因，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-RHDV-VP60，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后表達(dá)出了VP60 聚合蛋白。將表達(dá)產(chǎn)物純化后免疫Balb/C 小鼠制備多抗，然后應(yīng)用間接ELISA 和免疫印跡試驗(yàn)對(duì)重組蛋白的免疫原性進(jìn)行分析。結(jié)果表明GS/YZ 株VP60 截短基因在大腸桿菌中成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量約50 ku，其多抗效價(jià)為1∶32 000；免疫印跡試驗(yàn)證明表達(dá)產(chǎn)物具有很好的免疫原性；免疫重組蛋白后的易感兔在攻毒后全部存活，與傳統(tǒng)滅活疫苗具有同樣的保護(hù)效果，為研發(fā)亞單位疫苗提供了借鑒。

熊梅等[5]利用擴(kuò)增RHDV 的VP60 全長(zhǎng)基因，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-VP60，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，成功表達(dá)重組蛋白，后續(xù)的免疫印跡試驗(yàn)表明表達(dá)的病毒蛋白具有與VP60 單抗良好的反應(yīng)原性。利用純化后的VP60 蛋白與兔的肝臟細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行pull-down 實(shí)驗(yàn)，分析出與RHDV VP60 蛋白相互作用的兔肝臟細(xì)胞膜蛋白為ATP 合成酶β亞基，說(shuō)明ATP 合成酶β 亞基可能與RHDV 的感染有關(guān)。

李傳山等[6]應(yīng)用利用原核表達(dá)載體pET32a 構(gòu)建成功了RHDV 西北分離株VP60 蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)大腸桿菌BL21 表達(dá)后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，VP60 蛋白成功表達(dá)，重組蛋白分子質(zhì)量約為75ku。隨后的免疫印跡試驗(yàn)證明，原核表達(dá)的VP60 蛋白具有免疫原性。該研究進(jìn)一步表明兔出血癥病毒在我國(guó)西北干旱半干旱的自然條件下其遺傳變異和免疫學(xué)特征沒(méi)有較大變化。

3.2 真核表達(dá)系統(tǒng)

張帥等[7]運(yùn)用分子克隆技術(shù)，使用Hr1、Hr3、WPRE、SV40、CAG、Melt 等順式作用元件及元件組合對(duì)pFastBacDual 供體質(zhì)粒進(jìn)行改造后轉(zhuǎn)染sf9 細(xì)胞，成功提高了兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60 在Bacto-Bac 系統(tǒng)的表達(dá)量。經(jīng)免疫鑒定，表達(dá)的重組VP60 蛋白既能夠和VP60 單抗發(fā)生反應(yīng)，也能和RHDV 多抗血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。

原冬偉等[8]、張夏蘭[9]分別將RHDV TP 株、Yaan株的VP60 基因擴(kuò)增，插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP60，轉(zhuǎn)染RK13 細(xì)胞和Vero 細(xì)胞后都表達(dá)出了VP60蛋白。隨后他們又用重組質(zhì)粒分別免疫了小鼠和1月齡試驗(yàn)兔。動(dòng)物試驗(yàn)表明，重組質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。

陳柳等[10]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)RHDV VP60蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，VP60 蛋白能在sf9 昆蟲細(xì)胞中正確表達(dá)，能自組裝形成病毒樣顆粒；表達(dá)的VP60 蛋白定位于sf9細(xì)胞的細(xì)胞膜上，VP60 蛋白可能有助于RHDV 感染并入侵宿主細(xì)胞。

4 VP60 變異研究

向華等[11]、田浪等[12]克隆出了國(guó)內(nèi)RHDV 不同分離株的VP60 基因，與GenBank 上的其他毒株進(jìn)行了比較，他們的研究結(jié)果表明，VP60 基因序列全長(zhǎng)都是1 740 bp，都是編碼579 個(gè)氨基酸，各毒株核苷酸序列同源性在90.0%到98.0%之間，氨基酸同源性在94.1%到99.0%之間，強(qiáng)毒株間的氨基酸同源性為95%～100%，氨基酸變異多發(fā)生于C、E區(qū)，且氨基酸變異沒(méi)有引起VP60 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的根本性變化。

陳銘等[13]應(yīng)用RT-PCR 方法克隆出了RHDV 榮昌分離株的VP60 主要抗原表位基因序列，測(cè)序后，與RHDV 其他16 株的主要抗原表位序列進(jìn)行了比較分析，研究結(jié)果表明RHDV 榮昌分離株的主要抗原表位基因大小為506 bp，與其他16 株的核苷酸序列同源性較高，推導(dǎo)的氨基酸同源性可達(dá)80%。

5 展 望

VP60 蛋白是RHDV 的結(jié)構(gòu)蛋白，在感染宿主和誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中起著重要的作用，是國(guó)內(nèi)外研究RHDV 的一個(gè)熱點(diǎn)和重要內(nèi)容，除了原核表達(dá)和真核表達(dá)之外，也有學(xué)者嘗試在馬鈴薯中表達(dá)該蛋白。隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究手段的更新，關(guān)于VP60 蛋白的結(jié)構(gòu)、在感染宿主中的作用和刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的機(jī)理將會(huì)更清楚，也會(huì)促進(jìn)學(xué)者研發(fā)出更有效的RHDV 疫苗和診斷試劑，更有助于RHDV 的防控和治療，降低養(yǎng)兔業(yè)的損失，保障我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展。