劉彬彬 龔道方 陳振華 郭婧瑋 余艷艷 劉豐平 歐陽輝 譚云洪

2018年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球結(jié)核病報告提出，中國結(jié)核病診斷方面的問題之一為中國肺結(jié)核細菌學(xué)檢出率低，僅為31%，遠低于世界平均水平(57%)[1]。目前，市場上不斷涌現(xiàn)出各種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的檢測方法并廣泛應(yīng)用于結(jié)核病實驗室診斷領(lǐng)域，從其中選擇一種適合不同實驗室條件、準確且性價比高的檢測方法尤為重要。目前，湖南省每年肺結(jié)核患者的病原學(xué)陽性檢出率較低，且實驗室診斷技術(shù)的普及程度不夠，因此，本課題組采用前瞻性的方法，通過對結(jié)核病患者同一份痰標本同時進行液基夾層杯涂片(采用集菌法；簡稱“涂片法”)、L-J固體培養(yǎng)法(簡稱“L-J培養(yǎng)法”)和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(采用恒溫擴增法；簡稱“恒溫擴增法”)，比較3種方法對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢出率的差異，為湖南省各家結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)的選擇提供參考依據(jù)。

對象和方法

一、研究對象

采用隨機數(shù)字表的方法，從湖南省120家結(jié)核病定點醫(yī)院中抽取3家作為研究現(xiàn)場，分別為瀏陽市人民醫(yī)院、醴陵市湘東醫(yī)院、桃江縣人民醫(yī)院。以3家醫(yī)院2018年11月1日至12月31日就診的肺結(jié)核可疑癥狀者(咳嗽、咳痰2周及以上或痰中帶血)為研究對象，根據(jù)臨床癥狀、胸部X線攝片及實驗室檢查項目結(jié)果，并依據(jù)《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[2]的標準對肺結(jié)核患者進行診斷。3家醫(yī)院入選患者共636例，剔除未留取標本的患者，最終628例患者納入本研究。其中，男463例(73.7%)，女165例(26.3%)；年齡6～94歲，平均年齡(59.4±15.2)歲。

二、研究方法與內(nèi)容

采用配對設(shè)計的方法，即一份痰標本同時進行涂片法、L-J培養(yǎng)法和恒溫擴增法進行檢測，再進行比較，具體方法如下。

1.標本留取及L-J固體培養(yǎng)：每例患者用痰液收集瓶收集3～5 ml痰標本(可多次留)，首先采用4%的氫氧化鈉溶液對痰標本進行充分液化，靜置15 min后用無菌滴管取0.1 ml接種到酸性羅氏培養(yǎng)基上(接種2管)，同時將剩余的液化標本送至分子生物檢測室。每周觀察1次培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)菌落生長后，將陽性菌株送至湖南省參比實驗室，由專門的工作人員挑取菌落完成涂片，菌落經(jīng)抗酸染色鏡檢呈陽性者報告培養(yǎng)陽性；2個月未見菌落生長報告培養(yǎng)陰性。同一例患者的2管接種標本中，任何一管發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌生長即判定為L-J培養(yǎng)陽性。

2. 恒溫擴增法：吸取培養(yǎng)后剩余的充分液化的痰標本1 ml加入帶旋蓋的離心管中(同時將剩余的液化痰標本送至液基涂片室)，以離心半徑40 cm，12 000 r/min離心5 min，棄上清液。再加入生理鹽水1 ml，混勻，以離心半徑40 cm，12 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入100 μl的DNA提取液，100 ℃ 加熱10 min，加熱后迅速冷卻(置于-20 ℃冰箱)10 min，以離心半徑40 cm，12 000 r/min 離心2 min，將上清液加入含有混勻試劑的PCR管中，蓋好管蓋，以離心半徑40 cm，10 000 r/min 離心5 s，立即進行擴增反應(yīng)；反應(yīng)程序：63 ℃，反應(yīng)時間45 min(恒溫擴增熒光檢測儀型號：Deaou-308C)。結(jié)果判讀標準為：若擴增曲線呈“S”型，檢測結(jié)果為陽性，即含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；如果擴增曲線不呈“S”型，是一條直線或傾斜的直線，檢測結(jié)果為陰性，即不含結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

3. 涂片法：將剩余的所有充分液化的痰標本轉(zhuǎn)入液基夾層杯(液基夾層杯由湖南天騎生物科技有限公司生產(chǎn))中，再加入適量的液基專用消化液(不能超過20 ml)，將夾層杯置于干片機中60 ℃滅活10 min，再將其置于離心機中，以離心半徑20 cm，4500 r/min離心5 min，脫蓋輕緩棄去所有上清液，置干片機中60 ℃干片8 min，滴加染液A完全覆蓋住基膜，置于干片機中60 ℃熱染5 min，棄掉A液，用水緩慢沿杯壁沖洗2遍，滴加B液5～10滴，脫色90 s，用水緩慢沖洗2遍，脫色2次直至殘余的A液脫完，滴加C液5～10滴復(fù)染1～5 min，棄去C液，緩水沖洗2次，用取片針將夾層杯內(nèi)底膜頂出，用鑷子夾出基片，靠近杯底的一面朝上，用吸水紙吸干表面水分。滴一滴中性膠于玻片，菌膜朝下封片。滴加鏡油，使用顯微鏡100倍油鏡閱片。

4.陽性菌株的菌種鑒定：將運送到湖南省結(jié)核病參比實驗室的陽性菌株進行涂片染色，挑取抗酸染色結(jié)果為陽性的適量菌落至裝有生理鹽水和玻璃珠的磨菌瓶中，振蕩混勻成菌液，靜置15 min 后，用無菌滴管吸取0.1 ml到對硝基苯甲酸(PNB)上，置溫箱培養(yǎng)1個月后觀察結(jié)果。若PNB培養(yǎng)基上有菌落生長，提示為非結(jié)核分枝桿菌；若無菌落生長，提示為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。同時吸取0.1 ml滴到MPB64抗原檢測板上，15 min后觀察結(jié)果，檢測板只有1條紅色的線為陰性，即提示非結(jié)核分枝桿菌或者少量MPB64抗原陰性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；出現(xiàn)2條紅色的線為陽性，即提示結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。最后，將PNB陽性、MPB64陰性，PNB陰性、MPB64陰性，PNB陽性、MPB64陽性的菌株分別提取DNA，將DNA送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行測序，最終確定是否為非結(jié)核分枝桿菌。

5.評價指標：對比分析3種檢測方法對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性檢出率的差異；并以臨床診斷為參考標準，計算各種檢測方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致率，以及以患者進行每項檢測的實際支出費用為準，計算每種方法的檢測費用。

計算公式：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(兩種方法檢測均為陽性例數(shù)+兩種方法檢測均為陰性例數(shù))/檢測總例數(shù)×100%。

3種方法發(fā)現(xiàn)病原學(xué)陽性患者的平均檢測費用：每種方法的檢測費用均按市場價計算，即按患者進行上述檢測實際支出的費用計算。液基夾層杯涂片的市場價為120元/例；L-J固體培養(yǎng)的市場價為50元/例；結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(恒溫擴增法)的市場價為260元/例。

三、質(zhì)量控制

項目研究現(xiàn)場的選擇嚴格按照隨機抽樣方法抽取，以最大程度地反映湖南省的情況；所有參加此項目的工作人員均進行過嚴格系統(tǒng)的項目啟動培訓(xùn)，掌握實施方案，項目實施過程中嚴格按照實施方案標準進行患者納入、表格登記、實驗操作、結(jié)果判斷等，并同時每天做好相關(guān)儀器設(shè)備的維護保養(yǎng)；實驗操作過程中每批測試均做陰性、陽性質(zhì)控標本的測試。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行整理，并通過雙人核實。采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。3種方法兩兩之間結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢出率的比較采用配對四格表的卡方檢驗，檢驗水準α=0.05/3=0.017；3種方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致率的比較，采用計算率的95%的置信區(qū)間進行比較。

結(jié) 果

一、臨床診斷結(jié)果

628例可疑肺結(jié)核患者中，臨床最終診斷為肺結(jié)核患者153例(24.4%)；非肺結(jié)核患者475例(75.6%)，包括非結(jié)核分枝桿菌肺病6例。其中NTM肺病患者先經(jīng)過PCR檢測確定為NTM，再取患者培養(yǎng)陽性菌株提取DNA送至測序公司進行測序，最終診斷為NTM肺病。

二、3種方法陽性檢出率和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性檢出率情況

在肺結(jié)核可疑癥狀者中，L-J培養(yǎng)法、涂片法和恒溫擴增法的陽性檢出率分別為14.8%(93/628)、13.9%(87/628)和12.3%(77/628)。培養(yǎng)共接種1256管，有32管污染(64管)，污染率為5.1%；剔除6例NTM肺病患者后，涂片法、L-J培養(yǎng)法和恒溫擴增法的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性檢出率分別為13.5%(84/622)、14.0%(87/622)和12.2%(76/622)。采用配對設(shè)計的卡方檢驗(剔除6例NTM肺病患者和32例培養(yǎng)污染的患者)，結(jié)果顯示：每兩種方法結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性檢出率之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1～3。以臨床診斷為參考標準計算3種方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致率及其95%置信區(qū)間，三者之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表1 涂片法與L-J培養(yǎng)法的配對四格表

表2 L-J培養(yǎng)法與恒溫擴增法的配對四格表

表3 涂片法與恒溫擴增法的配對四格表

表4 以臨床診斷為參考標準判斷3種方法檢測的診斷效能

表5 3種方法的平均檢測費用

三、3種方法的平均檢測費用

3種方法發(fā)現(xiàn)1例病原學(xué)陽性患者的平均檢測費用從高到低依次為恒溫擴增法、涂片法、L-J培養(yǎng)法。見表5。

討 論

最新版的肺結(jié)核診斷指南——《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[2]中將結(jié)核病分子生物學(xué)檢測納入了結(jié)核病病原學(xué)檢查范疇，這將對各種結(jié)核病分子生物學(xué)檢測方法提出更高的要求；傳統(tǒng)的直接涂片法簡單快捷、成本低、易普及，目前仍是國內(nèi)最普遍使用的結(jié)核病實驗室檢測手段[3]，但是其陽性檢出率低，難以滿足臨床診斷需求，因此本研究采用涂片法、L-J培養(yǎng)法和恒溫擴增法同時檢測疑似肺結(jié)核患者的痰標本，判斷3種不同檢測方法陽性檢出率的差異。

本研究結(jié)果顯示，3種檢測方法對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性檢出率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；以臨床診斷結(jié)果為參考標準，3種方法的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。代小偉等[4]、宋紅煥等[5]和馬曉光等[6]的研究結(jié)果均顯示分子生物學(xué)方法的陽性檢出率高于傳統(tǒng)涂片法，這與本研究的結(jié)果不完全一致。原因可能是：(1)不同研究的試驗設(shè)計方法不完全相同，本研究采用的是配對設(shè)計的前瞻性研究，而部分研究則采用成組設(shè)計的回顧性研究，一般成組設(shè)計的回顧性研究存在較大的偏倚，在方法之間進行結(jié)果的比較時，配對設(shè)計比成組設(shè)計的數(shù)據(jù)更有說服力；(2)所選用的分子生物學(xué)方法不完全相同，目前上市的結(jié)核病分子生物學(xué)檢測方法種類很多，不同試劑盒的檢測靶標、引物設(shè)計、擴增方式和條件均不完全相同；(3)本研究采用的涂片法是液基夾層杯涂片技術(shù)，其雖也屬于涂片技術(shù)，但不同于傳統(tǒng)的涂片方法，其采用的是“集菌法”，通過離心過濾將液化后的所有痰液全部積聚在一張膜上，再經(jīng)過抗酸染色鏡下觀察，其最低檢出限值沒有數(shù)據(jù)可查，而培養(yǎng)的最低檢出限值大約為100菌落形成單位(CFU)/ml[7]，分子生物學(xué)檢測方法的最低檢出限值為10～104CFU/ml[8]，簡單涂片法的最低檢出限值為103～104CFU/ml[9]，從方法原理上就能推測液基夾層杯的最低檢出限是高于傳統(tǒng)涂片法的。并且平均發(fā)現(xiàn)1例病原學(xué)陽性患者的檢測費用由低到高依次為L-J固體培養(yǎng)、涂片法、恒溫擴增法。這提示實驗室在這三類診斷技術(shù)方法之間做選擇時，在首要考慮各方法陽性檢出率的基礎(chǔ)上，需綜合考慮各種方法的優(yōu)勢和局限性：液基夾層杯涂片技術(shù)操作簡單，工作人員依存性高，普及程度較高，可當天出具報告，但是只能鑒定到“是否為抗酸桿菌”的水平；L-J固體培養(yǎng)檢測費用低，操作相對簡單，且可獲得活菌進行藥物敏感性試驗，但是結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，耗時長，需5～8周時間，明顯滯后于臨床對肺結(jié)核早期診斷的期望[10]；核酸檢測生物安全程度高，可當天出具報告，結(jié)果可鑒定到“是否為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群”的水平，但是對實驗室條件要求較高并且檢測費用較高。

因此，實驗室在進行診斷技術(shù)的選擇時，應(yīng)該綜合考慮當前實驗室條件、試劑成本、時效性、操作依從性和結(jié)果準確性等因素，選擇最適合當?shù)氐慕Y(jié)核病診斷技術(shù)。如果在經(jīng)濟差的地區(qū)，尤其在基層地區(qū)，建議傾向選擇使用液基夾層杯涂片和L-J固體培養(yǎng)；若在經(jīng)濟條件好、實驗室條件允許的地區(qū)，可根據(jù)情況同時使用液基夾層杯涂片、L-J固體培養(yǎng)和結(jié)核分枝桿菌核酸檢測，從而保證更快、更準確地獲得檢測報告。