孫錦霞 張晴雯 李銀虹 姜昕

結(jié)核病仍然是威脅全球健康的一種感染性疾病。2019年WHO最新數(shù)據(jù)顯示，2018年感染MTB的新發(fā)患者約1000萬例，有55.8萬例利福平耐藥新發(fā)患者，其中有82%是耐多藥結(jié)核病患者，排名前三位的國家是印度、中國和印度尼西亞[1]。我國的結(jié)核病防治形勢依然非常嚴峻。耐藥、潛伏感染、與HIV并發(fā)感染等問題是實現(xiàn)控制結(jié)核病面臨的巨大挑戰(zhàn)[2]。

MTB是胞內(nèi)寄生菌，主要存在于巨噬細胞內(nèi)，因此固有免疫在清除MTB中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。自噬是存在于真核生物體內(nèi)的一種高度保守的生物過程，指通過溶酶體介導(dǎo)的胞內(nèi)組分的自我消化和再利用來維持細胞穩(wěn)態(tài)的過程[3]。自1963年首次提出自噬這一概念以來，自噬在抵抗、清除胞內(nèi)病原體中的重要作用也被越來越多的研究所證實[4-8]。通過誘導(dǎo)或增強巨噬細胞的自噬作用來清除胞內(nèi)的MTB在2004年被Gutierrez等[9]首次證明。

宿主為導(dǎo)向的治療策略(host-directed therapies，HDT)是一種新興的治療理念，通過小分子化合物對宿主免疫反應(yīng)的調(diào)控來更好地控制MTB。與抗生素作用不同的是：HDT藥物直接調(diào)節(jié)宿主細胞的免疫功能，從而避免了MTB耐藥性的發(fā)生。在結(jié)核病治療過程中，輔以自噬誘導(dǎo)劑來增強宿主細胞的自噬功能，能縮短治療周期，降低復(fù)發(fā)和再感染率[10-11]。

楊梅素(myricetin，MYR)是一種多羥基黃酮類化合物，具有較強的抗腫瘤[12]、抗氧化[13]、抗炎[14]、抗菌[15]、抗病毒[16]和鎮(zhèn)痛[17]等多種生物活性。楊梅素在MTB感染中的作用，還未見相關(guān)報道。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)了楊梅素具有一定的調(diào)控MTB感染巨噬細胞自噬的能力，為此本研究以楊梅素為研究對象，探討經(jīng)典自噬通路——磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號通路在楊梅素誘導(dǎo)MTB感染的巨噬細胞發(fā)生自噬中的作用。

材料和方法

一、材料及試劑

MTB H37Ra(ATCC25177)、小鼠巨噬細胞Raw 264.7由本實驗室保存；楊梅素購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自以色列BI公司；Middlebrook 7H9、7H10培養(yǎng)基購自美國BD公司；CCK8購自上?；鶆ι锟萍脊?；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA細胞裂解液購自上海碧云天公司；兔抗鼠LC3、p62、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt單克隆抗體購自美國CST公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體購自美國Proteintech公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗購自美國CST公司。

二、方法

1. Raw 264.7細胞的培養(yǎng)：Raw 264.7細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2. 楊梅素對Raw 264.7細胞的細胞毒性實驗：楊梅素用DMSO溶解制備成100 mmol/L的藥物儲液，Raw 264.7細胞生長至對數(shù)期，收集后鋪板于96孔板中，細胞濃度為2×104/孔，加入不同濃度(25、50、100、150、200 μmol/L)的楊梅素，并設(shè)空白組、DMSO對照組，每組設(shè)6復(fù)孔。在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，避光加入CCK-8(cell counting kit-8)，10 μl/孔，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，酶標(biāo)儀測定各孔的吸光度值(A450值)，根據(jù)各孔平均值，繪制細胞的生長曲線。細胞存活率(%)=(待測樣品-空白組)/(對照組-空白組)×100%。

3. MTB H37Ra的培養(yǎng)：H37Ra菌株用含有10% 白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(albumin dextrose catalase，ADC)營養(yǎng)添加劑的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約21 d生長至對數(shù)期。

4. H37Ra菌株感染Raw 264.7細胞模型的建立：Raw 264.7細胞離心收集后，鋪板于6孔板中，細胞濃度為1×106/孔，設(shè)空白組、模型組、藥物處理組，每組3個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。收集生長至對數(shù)期的MTB，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，按感染復(fù)數(shù)(MOI，即細菌∶細胞=10∶1)加入模型組、藥物處理組，共孵育4 h后，PBS洗3遍，以便棄掉未進入胞內(nèi)的MTB；而后細胞分別采用不同濃度的楊梅素處理不同的時間，模型組用PBS處理。

5. 菌落形成單位(CFU)法檢測楊梅素對MTB感染的Raw 264.7細胞中細菌的殺滅作用：楊梅素誘導(dǎo)自噬的最佳濃度100 μmol/L作用于感染細胞模型，并設(shè)空白組、模型組。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)72 h 后，PBS洗3遍，收集細胞中加入100 μl的0.1% Triton-100，冰浴10 min，釋放胞內(nèi)MTB，各組分別用PBS稀釋至106倍，設(shè)3個復(fù)孔，涂板于7H10固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)21 d后進行菌落計數(shù)。楊梅素對胞內(nèi)MTB的抑制率(%)=(模型組胞內(nèi)菌-楊梅素組胞內(nèi)菌)/模型組胞內(nèi)菌×100%。

6. 蛋白免疫印跡法(western blot，WB)檢測Raw 264.7細胞相關(guān)蛋白的表達水平：在自噬相關(guān)蛋白(LC3和p62)的檢測中，以不同濃度(12.5、25、50、100 μmol/L)的楊梅素處理模型組細胞24 h；在自噬通路相關(guān)蛋白(p-Akt和p-mTOR)檢測中，以100 μmol/L楊梅素處理模型組細胞30、60、180 min。不同處理組細胞分別用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入預(yù)冷的RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min。4 ℃、r=10 cm，12 000 r/min 離心15 min，收集蛋白上清。BCA法檢測蛋白濃度，然后將蛋白與上樣緩沖液(loading buffer)混合后煮沸。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)(SDS-PAGE)上分離蛋白并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)上，5%脫脂牛奶封閉2.5 h后，將NC膜轉(zhuǎn)移至預(yù)先按1∶1000進行稀釋好的兔抗LC3、p62、mTOR、 p-mTOR、Akt、p-Akt單克隆抗體，小鼠抗 β-actin單克隆抗體中，4 ℃ 孵育過夜。TBST洗3遍，每遍10 min后，將膜放入1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗中，室溫下孵育1 h，TBST洗3次。用ECL試劑盒在Protein Sample儀器上進行顯影，并通過Image J軟件對蛋白質(zhì)的表達進行像素的灰度值測定與分析。

三、制圖與統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、楊梅素對Raw 264.7細胞活力的影響

在不同時間點(24、48、72 h)用CCK8法檢測不同濃度(0、12.5、25、50、100、200 μmol/L)楊梅素處理后細胞的存活情況。結(jié)果顯示，楊梅素作用24 h和48 h細胞的存活率均能保持在90%左右，200 μmol/L 的楊梅素處理細胞72 h后，Raw 264.7細胞的生存率仍能達到(79.65±1.36) %(表1)。為此后續(xù)實驗選擇100 μmol/L為最大藥物安全使用濃度。

二、楊梅素誘導(dǎo)MTB感染的Raw 264.7細胞自噬

利用Western bolt檢測自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和p62蛋白的表達情況。以小鼠肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，模型組與藥物處理組的LC3Ⅱ和p62蛋白的表達差異見圖1。與模型組相比，楊梅素作用24 h能明顯誘導(dǎo)MTB感染的Raw 264.7細胞發(fā)生自噬，且隨藥物濃度的增加，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。模型組LC3Ⅱ蛋白的相對表達量較低，楊梅素不同濃度(12.5、25、50、100 μmol/L)處理均能促進LC3Ⅱ的表達；相較于模型組p62蛋白，藥物處理亦能抑制p62的表達，25 μmol/L楊梅素處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，12.5、50、100 μmol/L處理組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，具體見表2。楊梅素在最高作用濃度100 μmol/L 下，其LC3Ⅱ蛋白表達最高，同時p62蛋白表達最低。

三、楊梅素能明顯殺傷Raw 264.7細胞內(nèi)的MTB

楊梅素能降低Raw 264.7細胞的荷菌量。模型組胞內(nèi)的MTB數(shù)量為(39.67±2.33)×106，100 μmol/L 楊梅素處理72 h后，胞內(nèi)MTB的數(shù)量降為(31.33±0.88)×106，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.34，P=0.03)。楊梅素對胞內(nèi)MTB的抑制率(%)為21.02%(圖2)。

四、楊梅素通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導(dǎo)自噬

利用Western bolt檢測自噬經(jīng)典途徑PI3K/Akt/mTOR通路中關(guān)鍵接頭蛋白Akt、mTOR的磷酸化水平。以各組p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR來表示該組p-Akt和p-mTOR蛋白的相對灰度值。與空白組相比，空白+楊梅素組Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平?jīng)]有變化，可見楊梅素本身對空白

表1 不同濃度楊梅素作用下Raw 264.7細胞的存活率

圖1 Western bolt檢測不同濃度楊梅素作用下細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和p62的表達情況。與模型組相比，不同濃度楊梅素處理組能明顯促進LC3Ⅱ的表達，同時促進p62蛋白的降解

圖2 楊梅素對Raw 264.7細胞內(nèi)MTB的殺傷作用

空白+楊梅素組與空白組相比，楊梅素本身對細胞的Akt和mTOR蛋白的磷酸化無影響。與模型組相比，在不同時間點(30、60、180 min)，楊梅素均能明顯抑制Akt蛋白的磷酸化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；模型組p-mTOR蛋白水平僅在MTB感染后180 min明顯增加，楊梅素作用180 min亦能明顯抑制mTOR蛋白的磷酸化圖3 Western bolt檢測楊梅素對細胞中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白磷酸化水平的影響

討 論

目前，治療結(jié)核病的主要手段仍然是化療，而臨床普遍使用的一線抗結(jié)核藥物，仍停留在20世紀90年代研發(fā)的鏈霉素、異煙肼、利福平。然而由于耐藥、耐多藥、與HIV并發(fā)感染等問題的出現(xiàn)，使得開發(fā)新的抗結(jié)核藥物成為全球結(jié)核病防治事業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。針對殺滅MTB的藥物研發(fā)進展緩慢，HDT療法另辟蹊徑，從宿主角度出發(fā)，通過增強宿主的免疫力來清除MTB。MTB是一種胞內(nèi)寄生菌，通過抑制吞噬體的成熟從而在感染的巨噬細胞內(nèi)長期存活。自噬是細胞自發(fā)的對胞內(nèi)寄生菌的一種防御行為，已經(jīng)被確認可以通過不同機制清除胞內(nèi)菌。通過自噬，細胞能清除胞內(nèi)受損的細胞器、蛋白聚集物及進入細胞的病原體。經(jīng)典的自噬分為巨自噬、微自噬及分子伴侶介導(dǎo)的自噬[18]，通常所說的自噬即是巨自噬。自噬是由多種基因共同參與的漸進式的過程，以雙層膜包裹的需降解的胞內(nèi)成分形成的自噬體為標(biāo)志，通過與溶酶體的融合來降解其內(nèi)容物。自噬發(fā)生時，胞質(zhì)中的LC3會發(fā)生酶解形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ在ATG幫助下與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合后形成膜型的LC3Ⅱ，LC3Ⅱ會與自噬體膜融合，因此，通過LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的大小可以評估自噬水平的高低。而自噬流是否通暢，可以觀察p62蛋白的表達水平。p62蛋白是細胞接頭蛋白，是細胞內(nèi)多種蛋白復(fù)合物的主要成分[19]。當(dāng)自噬流通暢時，p62蛋白會與LC3形成復(fù)合物，p62作為自噬特異性底物與吞噬溶酶體內(nèi)的其他內(nèi)容物被一同降解[20]。自噬已經(jīng)成為治療結(jié)核病的新靶標(biāo)，其限制MTB生長的作用也被很多研究者所證實[21-22]。

表3 楊梅素作用不同時間對Akt和mTOR蛋白磷酸化水平的影響

楊梅素作為一種天然的黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性，且毒性較小，具有很好的應(yīng)用前景。楊梅素具有抗腫瘤、抗氧化、抗微生物、抗神經(jīng)退化、抗高血壓、抗過敏、抗酸、降血糖和抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用。近年來，大量的研究聚焦在了楊梅素的抗菌、抗炎活性上。楊梅素具有抑制金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌生長的作用[23-25]。然而結(jié)核病模型中，還未見有關(guān)楊梅素的相關(guān)報道。目前在楊梅素的作用機制研究方面，Cao等[26]發(fā)現(xiàn)楊梅素在較高濃度下可顯著降低肝癌細胞HepG2的活力，增加自噬體形成和選擇性吞噬過程中起關(guān)鍵作用的蛋白LC3的表達，降低mTOR及其下游信號分子的磷酸化，促使細胞的自噬過程進行。

本實驗中首先通過CCK8法檢測楊梅素對Raw 264.7細胞的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)楊梅素在100 μmol/L濃度以下作用24、48、72 h時細胞的存活率均在90%以上，可見楊梅素在100 μmol/L濃度下對細胞的毒性較小，因此本實驗選用100 μmol/L作為楊梅素的最大安全使用濃度。通過楊梅素干預(yù)MTB感染的小鼠Raw 264.7巨噬細胞，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)楊梅素能明顯促進自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達，與模型組(0.52±0.01)相比，楊梅素不同濃度(12.5、25、50、100 μmol/L)處理24 h均能促進LC3Ⅱ的表達(0.59±0.02, 0.65±0.01, 0.71±0.01, 0.83±0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.97、P=0.04，t=7.91、P=0.00，t=9.77、P=0.00，t=16.37、P=0.00)。同時，我們發(fā)現(xiàn)楊梅素能促進p62蛋白降解，較模型組p62蛋白(0.86±0.02)，不同濃度的楊梅素能抑制p62的表達(0.72±0.01，0.85±0.00，0.60±0.02，0.58±0.01)；與模型組比較，25 μmol/L楊梅素處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.81，P=0.46)，12.5、50、100 μmol/L 處理組均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.50、P=0.00，t=9.53、P=0.00，t=12.01、P=0.00)；從中得出楊梅素在100 μmol/L濃度下LC3Ⅱ的表達最高，同時p62的表達最低，可見楊梅素誘導(dǎo)自噬的最佳濃度為100 μmol/L。自噬是清除胞內(nèi)MTB的一種重要手段，因此選擇在自噬發(fā)生后對胞內(nèi)的MTB數(shù)量進行了CFU計數(shù)，發(fā)現(xiàn)楊梅素在100 μmol/L濃度下作用72 h后，能降低胞內(nèi)21.02%的MTB，雖然這種降低沒能產(chǎn)生數(shù)量級上的差異，但考慮到HDT只是一種輔助治療的手段，楊梅素可聯(lián)合其他一線抗結(jié)核藥物一起使用，以此達到降低藥物劑量、縮短療程和減少耐藥性產(chǎn)生的目的。筆者也檢測了楊梅素作用24 h和48 h后的CFU，發(fā)現(xiàn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原因可能是藥物在24 h剛啟動自噬，而自噬發(fā)生后對MTB的降解需要一定的時間，因此在72 h才產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)意義上的降低。通過刃天青法檢測楊梅素的體外殺菌作用，發(fā)現(xiàn)楊梅素本身在200 μmol/L濃度下對MTB無殺滅作用，因此，楊梅素降低MTB感染的巨噬細胞中的荷菌量不是由于楊梅素本身的殺菌作用引起的，而是通過啟動了自噬，從而引起細胞內(nèi)MTB的CFU下降。

PI3K/Akt/mTOR通路是最經(jīng)典的自噬通路，因此筆者首先考慮楊梅素誘導(dǎo)自噬的機制很可能是通過抑制了這條通路啟動了自噬。為了排除楊梅素本身對細胞PI3K/Akt/mTOR通路的影響，設(shè)立了空白+楊梅素組，與空白組相比，p-Akt和p-mTOR水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在100 μmol/L濃度下，楊梅素作用不同的時間(30、60、180 min)，與模型組相比(1.23±0.01、1.52±0.01、0.74±0.02)，Akt蛋白的磷酸化水平(0.99±0.01、0.96±0.01、0.43±0.01)均被顯著抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=27.60、P=0.00，t=30.06、P=0.00，t=18.60、P=0.00)；而模型組p-mTOR蛋白水平僅在MTB感染后180 min(0.57±0.00)明顯增加，楊梅素作用180 min 亦能抑制mTOR蛋白的磷酸化(0.46±0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=21.60，P=0.00)。

綜上所述，楊梅素通過抑制Akt和mTOR蛋白的磷酸化來抑制PI3K/Akt/mTOR通路，從而誘導(dǎo)MTB感染的巨噬細胞發(fā)生自噬來殺滅胞內(nèi)的MTB?；诒狙芯康膶嶒灲Y(jié)果，認為楊梅素有望成為新的 HDT 候選藥，作為輔助用藥與臨床一線抗結(jié)核藥物聯(lián)合用于結(jié)核病的防治。本實驗尚存在許多不足之處，比如：采用的無毒株、細胞模型相對單一、沒有開展整體實驗、沒有與抗結(jié)核藥物進行比較等。