廖乾秀，古建輝

（1.成都市第一人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，四川 成都；2.成都市第三人民醫(yī)院 普外科，四川 成都）

0 引言

現(xiàn)階段研究表明長(zhǎng)鏈非編碼 RNAHOTAIR 在多種腫瘤( 肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌等)中異常表達(dá)，并有多個(gè)研究表明 HOTAIR 的表達(dá)量與腫瘤患者的轉(zhuǎn)移、進(jìn)展及預(yù)后有重要的聯(lián)系，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HOTAIR 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和降低化療藥物敏感性等功能，目前結(jié)直腸腫瘤(Colorectal cancer)是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在世界上的各類腫瘤中發(fā)病率排在第三位，死亡率排在第二位，每年增加 約100 萬(wàn)個(gè)患者。 目前結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病率與死亡率在我國(guó)均呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康。 但是其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，既往研究多關(guān)注于蛋白編碼基因 Kirsten 鼠肉瘤病毒致癌基因(Kirstenrat sarcoma viral oncogene homolog ，K -ras)、腺瘤性息肉病基因(Adenomatous polyposis coli ，APC) 和p53 等的表達(dá)異常。 近年來(lái)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non -coding RNAs，lncRNAs) 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到重視，發(fā)現(xiàn)與直腸腫瘤相關(guān)lncRNAs 將有助于進(jìn)一步闡明其發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也能為結(jié)直腸腫瘤的診治提供新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月至2017 年12 月在我院就診的結(jié)直腸癌患者作為研究對(duì)象，并收集術(shù)后結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本240 例，并選取距腫瘤＞5cm 的正常結(jié)直腸組織作為對(duì)照。其中男130 例，女110 例，年齡39—79 歲，平均(57.5±10.6)歲。根據(jù)2015 年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UIcc)制定的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，I 期30 例，Ⅱ期80 例，Ⅲ期100 例，Ⅳ期30 例。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)任何放化療或分子靶向治療，手術(shù)切除的標(biāo)本立即放入液氮中保存，隨后轉(zhuǎn)入一80℃冰箱保存，整個(gè)收集、運(yùn)輸及保存過(guò)程均按照無(wú)酶原則操作。

1.2 試劑與儀器

1.3 方法

1.3.1 基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA-p21(Long intergenicnoncodng RNA-p21，LincRNA -p21)

LincRNA-p21 定位于人類第6 號(hào)染色體短臂(6p21.2) 上，長(zhǎng)度為2953bp，位于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)面。LincRNA-p21 基因是p53 基因重要的下游基因之一，其表達(dá)產(chǎn)物p21 蛋白是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白。P53 作為一種腫瘤抑制蛋白可以通過(guò)與E6 原癌蛋白結(jié)合來(lái)下調(diào)p21 蛋白表達(dá)水平，阻滯細(xì)胞周期，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2013 年，Zhai 等實(shí)驗(yàn)證明了p53 途徑的激活可以使結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中l(wèi)incRNA-p21 的表達(dá)水平升高，而且與配對(duì)的正常結(jié)腸組織樣本相比，lincRNA-p21在結(jié)直腸腫瘤患者樣本中的含量顯著降低，并且lincRNA-p21 表達(dá)水平與大腸癌分期、腫瘤組織及周?chē)芙?rùn)范圍和深度密切相關(guān)，進(jìn)而揭示了lincRNA-p21 在結(jié)直腸腫瘤中起腫瘤抑制的作用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌株

SCG7901 細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%的小牛血清、鏈霉素100mg/mL、青 霉 素100u/m1 的RPMI 1640 培 養(yǎng) 基，sCG790l 細(xì) 胞 的培養(yǎng) 在37 ℃、5%C0，相對(duì) 濕 度90% 的培養(yǎng) 箱中，間隔2—3 天更換培養(yǎng)基。參照l(shuí)i—pofectamine?！?000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將si—HOTAIR 序列轉(zhuǎn)染人sGc7901 細(xì)胞中，以亂序的negative contr01(Nc) 作為對(duì)照。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前10 斗llipo—fectamine 2000 加入 到240 斗l optimum 中，混勻并靜置10min，在取HOTAIR 干擾序列50nmol 溶于opIimum，混勻并靜置10min；PBS 沖洗2 次。轉(zhuǎn)染6h 后加人RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。

1.3.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制

將轉(zhuǎn)染Nc 和HOTAIR 干擾序列后48h 的sGC7901 細(xì)胞分別以4×104/孔接種于96 孑L 培養(yǎng)板中，每孔200 一。于接種后6、12、24、48、72、96h 每組取6 孔，加入M，ITI’(四甲基偶氮唑藍(lán))20肛l(5mg/m1)，溫育4h 棄上清，加入DMS0( 二甲基亞砜)150 斗l，微振蕩10min，于波長(zhǎng)490nm 酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A) 值。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A 值/陰性對(duì)照組A 值)×100%。

1.3.4 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 小時(shí)后，用無(wú)EDTA 的胰酶消化收集SGC790l 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞總數(shù)需要約1×106 個(gè)，5000r/min 離心3 min，棄上清后加PBS 重懸2 次并離心。加500 斗1 的Binding Buffer 重懸，先后加入5 斗l Annexin V—FITC 和5¨l Propidium Iodine 混勻，避光15min 后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 qRT—PCR 檢測(cè)HoTAIR 的表達(dá)水平

240 例結(jié)直腸癌患者中，腫瘤組織中的HOTAIR 的表達(dá)水平(6.52±2.36)顯著高于正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)水平(4.8l±1.61)(P=0.001)。 用qRT—PCR 檢 測(cè)HOTAIR 在 人 結(jié) 直 腸 癌 細(xì) 胞株MKN28、sGc7901、BGc823 及 正 常 結(jié) 直 腸 上 皮 細(xì) 胞GES 一1 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)上述四株細(xì)胞株HOTAIT 表達(dá)水平分別為：(9.52±0.42)、(13.61±0.38)、(8.41±0.63) 和(3.3±0.62)，人 結(jié) 直腸癌細(xì)胞株中HOTAIR 表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞(P＜0.05)。由于sGC7901 細(xì)胞株的H0 一TAIR 表達(dá)水平最高，以sGC7901 為研究對(duì)象進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2 HoTAIR 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中HOTAIR 的表達(dá)水平與腫瘤的大小及臨床分期明顯相關(guān)(P＜0.05)。腫瘤直徑大的、分期晚的癌組織中HOTAIR 表達(dá)水平明顯增高。癌組織中HOTAIR 表達(dá)水平與患者性別、年齡、吸煙狀況及分化程度無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，表1。

2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

我們用MTT 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染si—HOTAIR 后對(duì)sGc7901 增殖能力的影響，轉(zhuǎn)染后12 小時(shí)之內(nèi)，sGc7901 增殖未受到明顯影響，但是自轉(zhuǎn)染24 小時(shí)后細(xì)胞增殖能力開(kāi)始明顯比對(duì)照組下降。轉(zhuǎn)染si—HOTAIR 24h、48h 及76h 細(xì)胞的抑制率分別為：24.6%、31.4%和38.5%。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

si—HOTAIR 轉(zhuǎn)染至SGC7901 細(xì)胞48h 后，用FcM 分析各組細(xì)胞凋亡的變化。si—HOTAIR 組細(xì)胞凋亡率為：(24.3±2.3)%，si—Nc 組細(xì)胞凋亡率為：(6.72±1.3)%，與si—NC 組比較，si—HOTAIR 轉(zhuǎn)染后可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。

本次研究中有一些限制需要指出：①部分研究不能直接從原文獻(xiàn)獲得資料，我們通過(guò)其生存曲線提取HR 估計(jì)；②不同研究中高和低HOTAIR 表達(dá)的截?cái)嘀挡煌?，不能達(dá)到統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；③因?yàn)槌３＝Y(jié)果為陰性的實(shí)驗(yàn)研究通常不太可能被公開(kāi)，大部分的納入研究報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果；④本次Meta 分析僅僅納入了英文文獻(xiàn)，這可能為發(fā)表偏倚的原因之一；⑤由于不同病理亞型的腫瘤的預(yù)后會(huì)有很大的不同，納入的文獻(xiàn)中均未具體指出其研究消化道腫瘤的具體病理亞型，這亦可使HOTAIR 與腫瘤不良預(yù)后關(guān)系大小受到影響?？傊?，消化道惡性腫瘤組織中HOTAIR 表達(dá)上調(diào)與患者的不良預(yù)后有很大關(guān)聯(lián)。提示HOTAIR 可作為一種新的預(yù)測(cè)因子用于消化道腫瘤預(yù)后的判斷。患者HOTAIR 表達(dá)水平可指導(dǎo)術(shù)后治療； HOTAIR 可作為腫瘤治療新藥物的靶點(diǎn)。

表1 HOTAIRmRNA 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表1 HOTAIRmRNA 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

病理參數(shù) n HOTAIRmRNA 表達(dá)量 P 值性別 男 28 0.38±0.12 0.51女 18 0.41±0.16年齡 ≤60 歲 18 0.45±0.16 0.09＞60 歲 29 0.38±0.14腫瘤大小 ＜3cm 16 0.46±0.23 0.26≥3cm 30 0.38±0.19腫瘤位置 結(jié)腸 18 0.39±0.18 0.46直腸 26 0.36±0.16分化程度 高 28 0.38±0.12 0.038低 16 0.46±0.11淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 29 0.42±0.08 0.019無(wú) 18 0.38±0.06 TNM 分期 Ⅰ、Ⅱ 14 0.43±0.06 0.038Ⅲ、Ⅳ 36 0.39±0.08