董海鵬，孟凱

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，山東 濟(jì)南；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南）

0 引言

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）中醫(yī)屬于學(xué)“筋痹”“痹證”等范疇，是一種常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病[1]，膝關(guān)節(jié)最為常見(jiàn)[2]。原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原因迄今尚未完全明確，一般認(rèn)為是多種致病因素包括機(jī)械性和生物性因素的相互作用所致。其中年齡是主要高危因素，其他因素包括外傷、肥胖、遺傳、炎癥等。女性發(fā)病率較高，在絕經(jīng)后明顯增加，且與關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)雌激素受體有關(guān)。骨質(zhì)疏松因軟骨下骨小梁變薄變硬時(shí)，其承受壓力的能力下降，因此出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的幾率較高。

中藥牛膝屬多年生草本，根入藥。性味：苦、甘、酸，平。歸肝、腎經(jīng)。具有逐瘀通經(jīng)，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，利尿通淋，引血下行的功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》牛膝味苦、酸。主寒，濕痿痹，四肢拘攣，膝痛不可屈伸，逐血?dú)鈧ＥR床上常用牛膝配伍杜仲、桑寄生等治療骨關(guān)節(jié)炎，并有一定功效[3-5]。牛膝具有多成分、多靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)的作用。

1 材料與方法

1.1 牛膝化學(xué)成分及作用基因靶點(diǎn)、骨關(guān)節(jié)炎基因靶點(diǎn)信息獲取

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）檢索牛膝的化學(xué)成分及靶點(diǎn)。根據(jù)口服生物利用度（OB）＞30% 和類藥性（DL）＞0.18，篩選牛膝中的活性成分及其相關(guān)作用基因靶點(diǎn)。通過(guò)Genecard、OMIN 數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入關(guān)鍵詞“osteoarthritis”獲取與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用R 語(yǔ)言繪制將牛膝活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，獲得牛膝活性成的潛對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有作用的靶點(diǎn)，即兩者共同基因即為牛膝-骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。采用Cytoscape 軟件（Version3.7.1）構(gòu)建“疾病-藥物-活性成分-基因靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表疾病與藥物活性成分的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)圖中草綠色節(jié)點(diǎn)是藥物活性成分，通過(guò)構(gòu)建這一網(wǎng)絡(luò)圖探析牛膝對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)預(yù)測(cè)的蛋白相互作用關(guān)系。將牛膝-骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，研究物種為選擇為人類（Homo sapiens），獲得蛋白互作關(guān)系，并將結(jié)果以TSV 格式導(dǎo)出。

1.4 關(guān)鍵基因靶點(diǎn)本體（gene ontology,GO）

富集分析和基因相互作用（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路，分析利用Bioconductor 平臺(tái)和R 語(yǔ)言對(duì)獲得的基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析。首先在R 中進(jìn)行安裝包的安裝，安裝包包括"colorspace"、"stringi"、"DOSE"、"clusterProfiler"、"pathview"導(dǎo)出GO 富集分析表格，并繪制dotplot 點(diǎn)圖。KEGG 通路富集分析的安裝語(yǔ)言同上，可導(dǎo)出KEGG 富集分析表格，KEGG 通路圖，并繪制dotplot 點(diǎn)圖。

2 結(jié)果

2.1 牛膝活性成分的通過(guò)

TCMSP 平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，且OB＞30% 和DL＞0.18，篩選得到牛膝潛在活性成分，見(jiàn)表1。

表1 牛膝中潛在活性成分

2.2 牛膝活性成分對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP 平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，篩選活性成分對(duì)應(yīng)的潛在作用靶點(diǎn)，去除無(wú)效和重復(fù)靶點(diǎn)后，得到牛膝潛在活性成分的作用靶點(diǎn)100 個(gè)。利用Genecard 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，檢索“osteoarthritis”，共得到骨關(guān)節(jié)炎疾病的潛在作用靶點(diǎn)2397 個(gè)。利用R 語(yǔ)言獲得共同基因靶點(diǎn)為63 個(gè)（表2）。

2.3 疾病-藥物-活性成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

牛膝與骨關(guān)節(jié)炎作用靶點(diǎn)相關(guān)的藥物的潛在活性成分有16個(gè)，為poriferasta-7，22E-dien-3beta-ol、28-norolean-17-en-3-ol、berberine、coptisine、wogonin、delta 7-stigmastenol、baicalein、epiberberine、beta-sitosterol、Inophyllum E、kaempferol、Spinasterol、Stigmasterol、palmatine、beta-daucosterol_qt、quercetin?；钚猿煞?、基因靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化（圖1）。結(jié)果表明， quercetin、kaempferol、wogonin 等連接度較高，以上成分是牛膝治療骨關(guān)節(jié)炎的重要成分。

2.4 基因靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將牛膝- 骨關(guān)節(jié)炎的63 個(gè)潛在的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，選擇物種為人類，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系并繪制蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖2）。排除2 個(gè)游離的無(wú)相互作用蛋白，該網(wǎng)絡(luò)圖共包括63 個(gè)節(jié)點(diǎn)，578 個(gè)邊。其中綜合數(shù)值最高，評(píng)分＞0.99 的相互作用蛋白為IKBKB、CASP8、RELA、CASP9、CYP1A1、IKBKB、IGF2、VEGFA、BCL2、BIRC5、CASP3、CASP8、CAV1、VEGFA、CAV1，這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中具有重要地位，這些基因靶點(diǎn)在牛膝對(duì)骨關(guān)節(jié)炎治療中具有重要意義。

2.5 基因靶點(diǎn)生物功能及通路分析

GO 富集分析結(jié)果顯示，牛膝的63 個(gè)潛在關(guān)鍵基因靶點(diǎn)的GO富集排名靠前的生物學(xué)功能主要為DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA 聚合酶II 特異性（15 個(gè)靶點(diǎn)PGR、ESR1、AR、RELA、TP63、FOS、HIF1A、FOSL1、NR1I3、ELK1、MYC、NFE2L2、PARP1、RUNX2、IRF1），RNA 聚合酶II 近端啟動(dòng)子序列特異性DNA 結(jié)合（14 個(gè)靶點(diǎn)PGR、ESR1、AR、PPARG、RELA、HIF1A、FOSL1、AHR、ESR2、ELK1、MYC、HSF1、RUNX2、IRF1），近端啟動(dòng)子序列特異性DNA 結(jié)合（14 個(gè)靶點(diǎn)PGR、ESR1、AR、PPARG、RELA、HIF1A、FOSL1、AHR、ESR2、ELK1、MYC、HSF1、RUNX2、IRF1），蛋白質(zhì)異二聚活性（13 個(gè)靶點(diǎn)PPARG、RELA、BCL2、MCL1、VEGFA、FOS、HIF1A、AHR、IKBKB、EGFR、ERBB2、CAV1、HSF1），核受體活性（7 個(gè)靶點(diǎn)PGR、ESR1、AR、PPARG、AHR、ESR2、NR1I3）轉(zhuǎn)錄因子活性（7 個(gè)靶點(diǎn)PGR、ESR1、AR、PPARG、AHR、ESR2、NR1I3）RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（7 個(gè)靶點(diǎn)ESR1、AR、GSK3B、FOS、AHR、ELK1、NFE2L2）等（圖3），表明牛膝就可以通過(guò)參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程而發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎作用。

KEGG 通路富集分析顯示，牛膝的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)主要富集的通路為卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染，人巨細(xì)胞病毒感染，乙型肝炎，細(xì)胞凋亡，流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路，麻疹，前列腺癌，TNF 信號(hào)通路等。牛膝的活性成分分布于多個(gè)通路，可通過(guò)各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎作用（圖4）。

3 討論

牛膝是臨床治療骨關(guān)節(jié)炎的常用中藥，其提取物具有保護(hù)軟骨細(xì)胞作用[6,7]。牛膝總皂苷能有效抑制OA 滑膜炎癥，改善關(guān)節(jié)粘連度，降低滑膜組織β-catenin 蛋白表達(dá)以及減少關(guān)節(jié)液TNF-1，IL-1β，MMP-3 因子含量[8]。牛膝總皂苷含藥關(guān)節(jié)液能有效提高細(xì)胞活力、促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、提高Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)，且降低軟骨細(xì)胞早期、晚期凋亡率[9]。牛膝醇提物能有效刺激軟骨細(xì)胞增殖，修復(fù)軟骨損傷，降低軟骨[10]。本研究旨在對(duì)牛膝治療骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制作初步探討，為臨床治療提供依據(jù)。研究表明牛膝與骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)成分16 個(gè)，共同作用靶點(diǎn)63 個(gè)，主要通過(guò)調(diào)控PGR、PPARG、PTGS1、AR、BCL2、CASP3、ESR1 等靶基因，通過(guò)卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染，人巨細(xì)胞病毒感染，乙型肝炎，細(xì)胞凋亡，流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化，糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE 信號(hào)通路，麻疹，前列腺癌，TNF 信號(hào)通路等調(diào)節(jié)。研究表明，其中活性成分黃連素（coptisine）對(duì)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解因子MMP-13 及ADAMTS-5 的表達(dá)有抑制作用，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨結(jié)構(gòu)具有一定的改善作用[11]。槲皮素（quercetin）能夠顯著促進(jìn)IL-1β 體外誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞的增殖[12]，可顯著降低MMP-13/TIMP-1 的比例，促進(jìn)抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解[13]，促進(jìn)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)。綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)牛膝藥治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，結(jié)果表明了牛膝的主要潛在活性成分及作用靶基因與骨關(guān)節(jié)炎作用通路的關(guān)系，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制提供了新思路。

表2 骨關(guān)節(jié)炎-牛膝基因靶點(diǎn)

圖1 疾病-藥物-活性成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 牛膝治療骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 牛膝活性成分治療骨關(guān)節(jié)炎基因靶點(diǎn)的GO 生物學(xué)過(guò)程富集分析

圖4 牛膝活性成分治療骨關(guān)節(jié)炎基因靶點(diǎn)的KEGG 代謝通路富集分析