覃文聘，高鵬，牛麗娜，焦凱

(軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室 口腔疾病國家臨床醫(yī)學研究中心 陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院黏膜病科，西安 710032)

異位礦化是指在肌肉、肌腱和韌帶等軟組織內快速形成異位骨的疾病[1]，大多由創(chuàng)傷性因素引起，常發(fā)生在髖、肘及肩等關節(jié)周圍的囊外組織中，導致關節(jié)強直或血管和神經受壓，嚴重限制關節(jié)活動并引起運動疼痛，從而影響患者生存質量[2]。目前，異位礦化主要采取輻射預防和外科切除治療[3]，然而治療后復發(fā)率較高[4]。此外，上述治療也會導致關節(jié)運動永久性受限、組織局部缺陷等并發(fā)癥。因此，需進一步研究異位礦化的發(fā)生機制，以達到優(yōu)化預防及治療的目的。以往研究顯示，多種發(fā)病機制參與了異位礦化的發(fā)生，如軟組織損傷導致的反復出血機化、局部微循環(huán)缺氧、遺傳因素及神經調節(jié)異常等[5]。研究表明，骨基質損傷后釋放的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)具有誘導異位礦化的能力，損傷區(qū)BMP-2可促進感覺神經分泌P物質和降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)等感覺神經肽，這些感覺神經肽的釋放導致活化的血小板、肥大細胞和中性粒細胞聚集到損傷部位，最終啟動軟骨成骨過程；另外，活化的血小板、肥大細胞和中性粒細胞等的功能也與神經的重構有關[5]?，F就外周神經促進創(chuàng)傷后組織異位礦化的研究進展予以綜述。

1 神經炎癥的作用

神經炎癥機制在誘發(fā)異位成骨中的關鍵作用已被證明[2,6]。神經炎癥是由感覺神經釋放感覺神經肽(P物質[7]和CGRP[8])介導，并作用于周圍的靶細胞(如肥大細胞)而產生的炎癥級聯。BMP-2常在創(chuàng)傷后釋放入血，其已被證明能直接誘導感覺神經元釋放神經炎癥相關蛋白P物質和CGRP等，并能誘導新生血管[9]。Salisbury等[10]利用腺病毒轉染的BMP-2過表達細胞建立小鼠異位礦化模型，在病毒轉染細胞后24 h開始，每間隔一天從組織中分離出蛋白，通過酶聯免疫吸附測定對組織內P物質和CGRP進行定量檢測。結果發(fā)現，兩種炎癥介質的表達水平在誘導異位礦化后24 h內明顯升高，在誘導后72 h和6 d再次升高。另有體外研究顯示，在加入重組BMP-2后，感覺神經元培養(yǎng)基中的P物質和CGRP水平快速升高[11]。為了進一步證明P物質在誘導異位礦化中的作用，Kan等[12]用P物質受體——神經激肽-1受體拮抗劑RP-67580和對照溶劑磷酸鹽緩沖液分別處理Nse-BMP-4異位礦化模型小鼠，結果發(fā)現RP-67580處理組的異位礦化誘導率顯著低于對照組，表明P物質對于誘導異位礦化具有重要作用。由于感覺神經元末梢均有瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)，TRPV1作為一種受到多種微環(huán)境因素刺激后釋放疼痛調節(jié)劑的疼痛離子通道，在異位礦化中起作用。Salisbury等[10]以TRPV1敲除小鼠及野生小鼠為研究對象，建立BMP-2誘導的異位礦化模型。結果顯示，與野生小鼠相比，TRPV1敲除小鼠異位骨形成量減少，且由BMP-2介導的P物質和CGRP增加也顯著受到抑制，表明BMP-2能通過激活感覺神經TRPV1，促進其釋放P物質和CGRP，進而誘導神經炎癥的發(fā)生，從而促進異位礦化[10]。

在神經炎癥過程中釋放的P物質和CGRP兩種感覺神經肽，已被證明能分別招募肥大細胞定位于周圍神經和促進肥大細胞脫顆粒[13]。Salisbury等[10]分別使用肥大細胞脫顆粒抑制劑色甘酸和對照試劑磷酸鹽緩沖液對小鼠進行預處理后，再采用BMP-2誘導異位礦化，10 d后對兩組的新生骨進行量化比較，結果顯示，色甘酸處理小鼠的異位成骨體積較對照小鼠顯著減小，表明肥大細胞脫顆粒在誘導異位礦化發(fā)生中具有重要作用。肥大細胞脫顆粒后釋放多種降解酶，包括乳糜酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶等，促進了包括神經在內的多種類型的組織重構。此外，許多神經末梢均有各種肥大細胞釋放的蛋白受體，在肥大細胞脫顆粒后被激活，進一步促進P物質和CGRP的釋放，構成一個促進神經炎癥的正反饋環(huán)路[5]。另外，肥大細胞脫顆粒釋放的血清素(5-羥色胺)與骨重建有密切聯系[14]。血清素與其受體的結合會導致去甲腎上腺素的釋放，去甲腎上腺素可激活β腎上腺素能受體信號通路并促進棕色脂肪組織在神經周圍的迅速發(fā)生，從而進一步促進骨生成[15]。

基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是一種能降解細胞外基質的明膠酶，其被證明與神經炎癥和血神經屏障的開放有關[13]。Rodenberg等[16]在BMP誘導異位礦化的小鼠模型中發(fā)現，誘導后48 h內異位礦化部位的神經血管周圍MMP-9高表達，7 d后微計算機斷層成像檢測到MMP-9定位的異位礦化形成部位，說明MMP-9在異位礦化形成中十分重要。Suehiro等[17]分別于傷后即刻與傷后1 d測定7例腦創(chuàng)傷患者全身動脈和頸內靜脈血中的MMP-9和白細胞介素-6水平，結果發(fā)現頸內靜脈中的MMP-9和白細胞介素-6水平與腦外傷炎癥嚴重程度顯著相關。Hackel等[18]運用高滲鹽水處理大鼠，使MMP-9的非催化性血栓素結構域與低密度脂蛋白受體相關蛋白-1結合，觸發(fā)胞外信號調節(jié)激酶1/2的磷酸化，誘導形成血神經屏障的緊密連接蛋白claudin-1下調，提示MMP-9與血神經屏障開放有關。Davis等[19]建立了腺病毒轉染的BMP-2過表達細胞誘導異位礦化的大鼠和小鼠模型并進行對比研究，結果發(fā)現MMP-9無論在大鼠還是小鼠的異位礦化部位48 h內均有較高的表達，但在小鼠體內，MMP-9被激活，而在大鼠體內，MMP-9未被激活。同時，該研究在骨骼遠端直接將腺病毒轉染的BMP-2過表達細胞注入肌肉中，小鼠體內會出現異位礦化而大鼠體內不會出現。上述結果提示，MMP-9的激活對異位礦化至關重要。

可見，組織創(chuàng)傷導致局部BMP的大量釋放，其可直接促進感覺神經肽釋放，導致肥大細胞脫顆粒和神經炎癥介質的釋放，從而促進局部神經炎癥發(fā)生，同時通過促進MMP-9的表達開放血神經屏障。

2 神經干細胞的作用

在異位礦化的形成過程中，關于骨祖細胞的來源有多種說法，包括來源于骨髓中的間充質干細胞[20]、肌肉纖維之間的間質細胞[21]、經上皮-間充質轉化的內皮細胞[22]等。Lazard等[23]通過給小鼠肌內注射腺病毒轉染的BMP-2過表達細胞誘導異位礦化，然后通過免疫組織化學方法追溯骨祖細胞來源，并用熒光激活細胞分類和免疫細胞化學方法對其進行定量和進一步表征。結果發(fā)現，24 h內存在于外周神經內膜的claudin-5陽性細胞同時表達成骨相關轉錄因子(Osterix，又稱SP7，一種成骨標志物)抗體、血小板源性生長因子受體(參與神經膠質-內皮細胞相互作用的神經干或祖細胞標志物)、musashi家族蛋白(一種在完全分化的細胞中不表達，但對神經干細胞具有高度特異性的RNA結合蛋白)和酪氨酸激酶受體2(內皮標志物)；48 h后這些細胞在神經內消失，隨后出現在血液和新骨形成處，證明骨祖細胞來源于周圍神經內膜的祖細胞。Olmsted-Davis等[24]通過建立三苯氧胺調控的Wnt1-Cre重組酶與td番茄紅(Tomato red，TR)受體基因雜交的譜系追蹤小鼠，即一種由三苯氧胺調控的TR系追蹤小鼠來追蹤細胞的神經內膜起源，同時使用抗體PS(phosphoSmad)1、 5和8檢測對BMP-2有反應的細胞。在運用腺病毒轉染的BMP-2過表達細胞誘導異位礦化模型中觀察到，少量的PS陽性細胞存在神經內膜內；在周圍神經的神經內膜中發(fā)現表達成骨細胞的特異性因子——SP7陽性細胞，在空腺病毒載體轉導模型的周圍神經中未觀察到SP7陽性細胞；且觀測到SP7、Dlx5(一種成骨細胞特異性因子)和PS在Wnt1+(TR+)細胞中表達。另外，Olmsted-Davis等[24]還對異位礦化患者標本進行了研究，發(fā)現異位礦化部位附近的神經內膜含有大量的PS陽性細胞，異位礦化患者的神經和骨組織中均存在SP7陽性細胞。上述結果表明，異位礦化的祖細胞來源于神經內膜。

骨祖細胞在發(fā)生后如何到達新骨形成部位并最終發(fā)揮作用引起了科研工作者的廣泛興趣。骨祖細胞要離開神經就必須穿過血神經屏障，研究發(fā)現循環(huán)中的祖細胞表面表達緊密連接分子claudin-5，但卻不參與構成任何緊密連接結構，推測claudin-5的表達很可能為其穿過血神經屏障提供了一種方式[23]。祖細胞進入循環(huán)后會在幾秒鐘之內遍布全身，研究證實在機體受到創(chuàng)傷后，血液循環(huán)中會很快出現神經來源的骨祖細胞[13,25]。骨祖細胞最終定位在新骨形成部位，從循環(huán)滲出到特定部位的過程要通過一種特殊分化的血管，這些血管被鑒定為H血管，其特征為標志物CD31和內皮黏蛋白的高表達[26]。Ramasamy等[27]研究發(fā)現，骨祖細胞選擇性地定位在H型毛細血管附近，但在骨干L型毛細血管(表達較低水平的CD31和內皮黏蛋白)周圍不存在，進一步證實了H血管在骨祖細胞到達新骨形成部位的重要作用。

3 外周神經對棕色脂肪組織的調節(jié)作用

在BMP-2誘導的異位礦化模型中，神經、血管和肌肉等軟組織也發(fā)生了一系列變化，其中棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)的出現是最早變化之一[5]。BAT是一種由冷暴露引起的獨特脂肪組織，其特征為表達解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)和血管內皮生長因子。與電子傳遞鏈中的標準ATP酶不同，UCP1能將ATP酶從電子傳遞鏈復合物中解離出來，使用于ATP合成的能量會以熱能的形式釋放。周圍神經中的小直徑傳入神經對熱刺激做出反應，誘導信號轉導并最終促進神經炎癥發(fā)生[14]。此外，UCP1具有非常高的催化效率，能迅速消耗氧氣，加之局部熱量產生導致微環(huán)境中氧氣的溶解度下降，最終造成細胞缺氧，從而有效促進了形成軟骨凝結[28]。同時缺氧的BAT會激活缺氧誘導因子-1α通路，上調BMP、血管內皮生長因子和神經纖毛蛋白-1等的表達[29-30]，促進成骨與成血管在異位礦化過程中的耦合[31]。

與異位礦化關系密切的棕色脂肪細胞不同于正常生理狀態(tài)下的棕色脂肪細胞，它們是短暫存在的，且來源于神經。Salisbury等[32]對患者的異位礦化病理組織進行檢測也發(fā)現，異位礦化中的棕色脂肪細胞表達UCP1，且表達關鍵轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α，但對正常棕色脂肪細胞的特征性標記CD137、TBX1(T-Box 1)、HOXC9(homeobox C9)的檢測為陰性，同時也缺乏關鍵轉錄因子PRDM16(PR domain-containing protein 16)的表達。這些結果表明，異位礦化組織內的棕色脂肪細胞與機體本身的棕色脂肪細胞起源不同。在用三苯氧胺調控的TR系追蹤小鼠來追蹤細胞起源的實驗中，Lazard等[23]采用BMP-2誘導異位礦化的小鼠模型進行研究，在誘導異位礦化5 d后，對組織進行免疫染色，證實大部分UCP陽性細胞同時TR陽性，提示棕色脂肪細胞可能來自神經內膜細胞。Salisbury等[15]采用BMP-2誘導異位礦化的小鼠模型進行研究發(fā)現，在BMP-2處理2 d后，坐骨神經內存在β3腎上腺素能受體陽性細胞，這些細胞也表達神經遷移標志物CD75；在處理4 d后，坐骨神經內的β3腎上腺素能受體陽性細胞數目顯著減少，同時在周圍的軟組織內發(fā)現了β3腎上腺素能受體陽性UCP1陽性細胞，這些細胞同時表達神經引導因子顫蛋白；在阻斷肥大細胞脫粒誘導的神經重構后，UCP1特異性RNA和蛋白表達完全消失，說明棕色脂肪細胞不僅起源于神經，且受神經炎癥調控。Salisbury等[5]認為，肥大細胞脫顆粒釋放的血清素會刺激損傷部位的交感神經細胞，進一步影響B(tài)AT的生成。另有研究發(fā)現，BAT的產生受交感神經系統(tǒng)的調節(jié)[5]。Lowell和Spiegelman[33]將交感神經在冷暴露或藥物刺激下對BAT的影響歸納為急性和慢性，UCP-1活性在幾秒鐘內增加，而UCP-1蛋白的增加、線粒體的生物發(fā)生及BAT的增生和肥大發(fā)生在數小時或數天之內。實驗發(fā)現，在犬和靈長類動物中使用β3腎上腺素能受體激動劑可以增加BAT含量[33]；臨床研究發(fā)現，嗜鉻細胞瘤成年患者體內存在更多的棕色脂肪沉積，這些結果支持交感神經在BAT的誘導、發(fā)生過程起重要作用[33]。

4 小 結

創(chuàng)傷后組織異位礦化的過程與外周神經密切相關，主要包括神經炎癥的作用、神經干細胞的作用和神經對棕色脂肪細胞的調控作用，從而導致血神經屏障開放、骨祖細胞遷移至新骨形成部位和BAT造成周圍低氧環(huán)境并促進新生血管長入。雖然異位礦化被認為是一個異常的病理性礦化過程，但事實上其可能反映周圍神經系統(tǒng)維持正常骨結構和功能的重要生理機制。生理狀態(tài)下，周圍神經系統(tǒng)將信號轉導至中樞神經系統(tǒng)以調節(jié)正常骨骼的日常重構；病理狀態(tài)下，BMP的釋放刺激感覺神經，啟動了一個超過正常水平的骨和軟組織再生程序，可能導致不正確的部位出現骨質沉積，即形成異位礦化。因此，通過靶向調節(jié)神經炎癥、神經干細胞和棕色脂肪細胞的作用可能成為臨床阻斷創(chuàng)傷后組織異位礦化的重要策略；此外，對異位礦化相關形成機制的研究亦可為牙、骨等硬組織缺損的治療提供參考。