郄春花，劉曄華，劉亞敏，李 穎，崔軍文

1.天津市第二人民醫(yī)院檢驗科，天津 300192；2.天津市第一中心醫(yī)院檢驗科，天津 300192；3.天津市第二人民醫(yī)院感染科，天津 300192；4.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384

布魯菌病是一種人畜共患病，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。為了控制和減少疾病在動物之間的傳播以及傳染給人類的風(fēng)險，需要對病原體進行快速、準確的檢測。臨床上用于確診布魯菌病的方法主要依靠血液及骨髓的細菌培養(yǎng)和血清學(xué)檢查，由于布魯菌生長緩慢，細菌培養(yǎng)耗時長，且受血清中抑菌物質(zhì)及抗生素的影響，難以達到早期診斷的目的[1]。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(LAMP)是NOTOMI等[2]開發(fā)的一種新型核酸體外擴增技術(shù)。LAMP不僅廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測,而且具有靈敏度高、特異性好、反應(yīng)時間短、操作簡單等優(yōu)點,特別適合病原微生物的現(xiàn)場即時檢測[3]。本研究針對布魯菌屬保守基因OMP 25設(shè)計LAMP引物，建立了一種實時熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(RealAmp)方法，該方法簡便、快速，以期實現(xiàn)布魯菌的現(xiàn)場即時檢測。

1 材料與方法

1.1菌株來源 實驗用菌株如下：布魯菌標準菌株豬種布魯菌S2由天津市動物疫病控制中心李秀梅老師贈送。16株布魯菌臨床分離株由天津市第二人民醫(yī)院微生物室保存。金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC 35218、肺炎克雷伯菌ATCC 70060、銅綠假單胞菌ATCC 27853、糞腸球菌ATCC 29212購自天津市臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑 恒溫?zé)晒鈾z測儀Fluo-Gene為北京弗羅朗生物科技有限公司產(chǎn)品；RealAmp試劑盒購自北京弗羅朗生物科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技公司；人血液基因組提取試劑盒購自Qiagen公司。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中布魯菌序列(No.AM694198.2)，針對布魯菌屬保守基因OMP 25，利用LAMP引物設(shè)計軟件設(shè)計4套引物，每套引物由F3、B3、FIP、BIP、FB和LB組成。引物序列由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司合成。LAMP引物的序列為F3：5′-CGT CGG CTA CGA CCT GAA-3′；B3：5′-ACC GGC CAG ATC ATA GTT CT-3′；FIP：5′-TCG TCC AAG CCG TTG TTA AGC TCC CGG TTA TGC CGT ACC T-3′；BIP：5′-GTG CCG GTC TCG AAG CCA AGT GTT GCC GTA CTG GGT GTA-3′；FB1：5′-GCG AAC CGG CAA TAC CAG CC-3′；LB1：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′；FB2：5′-GCG AAC CGG CAA TAC CAG C-3′；LB2：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′；FB3：5′-TGC GAA CCG GCA ATA CCA GC-3′;LB3：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′；FB4：5′-CTG CGA ACC GGC AAT ACC AGC-3′；LB4：5′-GCC GCG TTG AGT ACC GT-3′。

1.3.2細菌DNA模板的制備 向1.5 mL EP管中加入0.5 mL生理鹽水，然后用接種環(huán)在管壁上研磨成菌懸液，于80～90 ℃滅活30 min，12 000 r/min離心10 min后去掉上清液，按照細菌DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3RealAmp反應(yīng)體系 首先，將各引物分別配成工作液，F(xiàn)IP、BIP、F3、B3、FB、LB按照8∶8∶1∶1∶4∶4水平比混合成引物混合液。按照RealAmp試劑盒說明書配制RealAmp反應(yīng)體系。反應(yīng)過程在恒溫?zé)晒鈾z測儀Fluo-Gene中進行，反應(yīng)溫度為65 ℃，反應(yīng)時間為60 min。以2 μL無菌蒸餾水為模板設(shè)置陰性對照。以提取的標準菌株豬種布魯菌S2的DNA為模板，按照RealAmp試劑盒說明書的要求設(shè)置反應(yīng)條件，比較4套引物的擴增效率，選擇擴增效率最高的引物進行后續(xù)實驗。

1.3.4RealAmp檢測布魯菌的特異性驗證 提取過夜培養(yǎng)的標準菌株豬種布魯菌S2、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC 35218、肺炎克雷伯菌ATCC 70060、銅綠假單胞菌ATCC 27853、糞腸球菌ATCC 29212的細菌DNA，取2 μL作為模板，分別進行RealAmp反應(yīng)，驗證該方法的特異性。

1.3.5RealAmp檢測布魯菌的靈敏度實驗 提取過夜培養(yǎng)的標準菌株豬種布魯菌S2的細菌DNA，調(diào)整模板DNA水平為120 ng/μL，用無菌蒸餾水進行1∶10、1∶102、1∶103連續(xù)倍比稀釋直到1∶109，分別取稀釋后的DNA 2 μL作為反應(yīng)模板，用于RealAmp反應(yīng)，驗證方法的靈敏度。

1.3.6臨床應(yīng)用 提取培養(yǎng)的布魯菌臨床分離株的DNA，用RealAmp進行檢測。抽取疑似布魯菌病患者外周血2～3 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，患者同時抽取5～10 mL外周血做血培養(yǎng)。按照人血液基因組提取試劑盒的要求提取人全血基因組DNA，用已建立的RealAmp方法進行患者外周血微量布魯菌DNA檢測。

2 結(jié) 果

2.1最佳引物的篩選 當(dāng)反應(yīng)進行至10 min左右時，實驗管的熒光強度大幅度增加，直至反應(yīng)結(jié)束，儀器判定為陽性結(jié)果。陰性對照管熒光曲線一直處于平滑的狀態(tài)，直到反應(yīng)終止也沒有發(fā)生大幅度的曲線斜率的變化，儀器判定為陰性結(jié)果，說明沒有發(fā)生擴增反應(yīng)。實時熒光曲線表明，所有實驗管都在10 min左右擴增出目的基因。比較4套引物的擴增效率，選擇擴增效率最高的第2套引物進行后續(xù)實驗。

2.2特異性實驗 以非布魯菌標準菌株DNA為模板，本實驗均未出現(xiàn)擴增反應(yīng)，只有豬種布魯菌S2的DNA發(fā)生特異性擴增并被檢測出來。說明本研究的RealAmp方法對布魯菌檢測的特異性好，與非目標菌不存在擴增反應(yīng)。

2.3靈敏度實驗 布魯菌標準菌株DNA 1∶10～1∶107各水平檢測結(jié)果均為陽性，而1∶108、1∶109為陰性。RealAmp檢測布魯菌的靈敏度為1.2×10-5ng/μL。

2.4臨床應(yīng)用 用RealAmp方法檢測16株布魯菌臨床分離株的DNA后，擴增結(jié)果均呈陽性，表明該方法可用于布魯菌DNA的檢測。抽取28例疑似布魯菌病患者外周血2～3 mL，EDTA-K2抗凝，患者同時抽取5～10 mL外周血做血培養(yǎng)。提取EDTA-K2抗凝血中的血液基因組DNA，用已建立的RealAmp方法進行患者外周血微量布魯菌DNA檢測。其中12份標本RealAmp檢測為陽性結(jié)果，陽性率為42.9%；28份標本血培養(yǎng)結(jié)果顯示，11份標本為血培養(yǎng)陽性，陽性率為39.3%。新建的RealAmp方法與血培養(yǎng)的符合率為96.4%(27/28)。

3 討 論

布魯菌病是由布魯菌引起的一種傳染變態(tài)反應(yīng)性疾病，家畜和野生動物被認為是傳染源[4]。因為布魯菌病是一種全身性感染，可以影響任何器官或系統(tǒng)。布魯菌病具有獨特的流行病學(xué)和致病特征，其中一個獨有的特征是菌血癥在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用非常重要[5]。布魯菌病診斷的金標準是從血液或骨髓等培養(yǎng)物中分離出布魯菌[6]。目前布魯菌血癥的實驗室診斷依賴于血培養(yǎng)，因此建立快速檢驗布魯菌血癥的RealAmp方法，對布魯菌血癥的診斷和治療具有重要的意義。

LAMP通過設(shè)計的引物和置換DNA擴增技術(shù)，在30～60 min的恒溫條件下(通常為60～65 ℃)，利用高活性鏈置換Bst DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)，產(chǎn)生大量莖環(huán)狀擴增產(chǎn)物，從而實現(xiàn)對目的基因的快速檢測。LAMP自開發(fā)以來，已廣泛應(yīng)用于細菌、病毒和寄生蟲的檢測[7-9]。LAMP方法不僅對核酸提取要求低，而且靈敏度高，可從極微量的標本中擴增出目的基因，其靈敏度是傳統(tǒng)PCR的10～100倍[10]。LAMP反應(yīng)最重要的優(yōu)點是可以在恒定溫度下進行，不需要依賴特殊設(shè)備[11]。LAMP產(chǎn)物檢測最初應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳，后來開發(fā)了基于反應(yīng)過程中的副產(chǎn)物(白色焦磷酸鎂沉淀)濁度的肉眼或濁度儀檢測來判定擴增與否。最近，使用實時監(jiān)測熒光信號提高了擴增信號的可靠性[12]。

本研究建立的針對布魯菌OMP25基因的RealAmp方法只針對布魯菌擴增，對其他干擾菌不擴增，顯示出良好的特異性。本實驗選用的恒溫?zé)晒鈾z測儀Fluo-Gene及配套的RealAmp試劑盒，操作簡便、結(jié)果可視化，整個實驗在30 min內(nèi)即可完成。恒溫?zé)晒鈾z測儀Fluo-Gene的應(yīng)用，不僅使操作者遠離了溴化乙錠、紫外燈等對身體的危害，而且實現(xiàn)了對病原菌從始到終全封閉式檢測。目前，市場上常見的LAMP平臺主要有 Eiken公司生產(chǎn)的LA-200，Lumora公司生產(chǎn)的BART和 Optigene公司生產(chǎn)的GenieⅡ[13]。本實驗中應(yīng)用的檢測平臺Fluo-Gene所需要的時間最短，整個擴增過程僅需20 min。

本研究建立了特異、靈敏和可靠的RealAmp方法用于布魯菌DNA檢測。該方法能夠從布魯菌血癥患者外周血提取的DNA樣品中擴增出微量的布魯菌DNA，靈敏度可達1.2×10-5ng/μL。來自疑似布魯菌病患者的28份臨床標本，雖然RealAmp檢測陽性率與傳統(tǒng)的血培養(yǎng)(39.3%)陽性率基本持平，但是RealAmp僅需要外周血2～3 mL，且當(dāng)天即可得出結(jié)果，而血培養(yǎng)時間至少需要5 d，甚至20多天。與血培養(yǎng)相比，RealAmp簡便、快捷，可以方便地實現(xiàn)布魯菌血癥的現(xiàn)場即時檢測。

綜上所述，本研究針對布魯菌OMP25基因建立的RealAmp方法具有特異性強、靈敏度高、簡便高效等特點，為布魯菌的快速檢測提供了新的發(fā)展方向，具有良好的發(fā)展前景。