杜新雅， 李曉宇， 謝春， 武斌， 宋光保， 杜野

1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院口腔科，廣東深圳（518000）； 2.南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院特診中心，廣東廣州（510280）

Van der Woude 綜 合 征（Van der Woude sydrome，VWS）是一種常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率為1～3/30 000，遺傳外顯率為80%～94%［1］，特征是家族性下唇瘺伴唇裂或腭裂，部分患者伴有缺牙。本系列前期研究收集到14 個(gè)VWS 家系，37 例VWS 患者，致病基因?yàn)镮RF6 基因［2］；在家系9 中，VWS 先證者伴先天缺牙，先證者父親未有唇腭裂或者下唇瘺，表現(xiàn)為先天缺牙。先天性缺牙是人類常見的發(fā)育異常疾病之一，其發(fā)病率1.6%～20%［3］。其中缺失6 顆和6 顆以上牙齒（不包括第三磨牙）稱為多數(shù)牙缺失（oligodontia）；缺失6 個(gè)以下牙齒的稱為少數(shù)牙缺失（hypodontia）。臨床表現(xiàn)為散發(fā)性或家族性。遺傳和環(huán)境因素都可以導(dǎo)致先天性缺牙的發(fā)生，但是遺傳因素更為關(guān)鍵［3］，遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究進(jìn)展表明，有超過300 個(gè)基因參與牙齒發(fā)育的不同階段。目前研究發(fā)現(xiàn)的與人類先天性缺牙相關(guān)的基 因有WNT10A［4］，WNT10B［5］，AXIN2［6］，PAX9［7-8］，MSX1［9-10］等。上述研究顯示多數(shù)牙先天缺失與PAX9、AXIN2 密切相關(guān)［11］，而少數(shù)牙先天缺失主要與MSX1 基因突變或缺失有關(guān)［12］。然而，上述基因突變?cè)诨颊咧械臋z出率不高，這與非綜合征型先天缺牙可能是由多基因多因素共同調(diào)節(jié)控制有關(guān)［3］，有一些基因的單核苷酸多態(tài)性與先天性牙缺失的研究，涉及到MSX1［13］、AXIN2［14］等基因。本研究對(duì)VWS9 家系中2 名先天性牙齒缺失患者缺牙數(shù)分別為2 顆、5顆，診斷為少數(shù)牙先天缺失；據(jù)此筆者進(jìn)行了MSX1 基因的檢測(cè)，了解該家系少數(shù)牙先天缺失可能的致病基因。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

為VWS 系列研究中的家系9，先證者為深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院住院唇腭裂病例中發(fā)現(xiàn)的，先證者表現(xiàn)為唇腭裂伴下唇瘺，先天缺牙。筆者對(duì)每個(gè)家系成員進(jìn)行了表型調(diào)查，對(duì)于2 名有缺失牙的成員行全景斷層攝片以明確缺牙情況。所有家系成員的臨床表型由2 名有經(jīng)驗(yàn)的口腔醫(yī)師獨(dú)立檢查確診。同時(shí)將家系中其他2 名健康成員和隨機(jī)選取的60 名體檢者作為健康對(duì)照組（所有血液樣本提供者均填寫知情同意書），本研究通過了深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床及遺傳學(xué)資料分析

按照受累個(gè)體的臨床表型進(jìn)行登記總結(jié)，并繪制完整的系譜圖，明確可能的遺傳方式。系譜圖如圖1。對(duì)先證者及其父母進(jìn)行口內(nèi)、口外及全身系統(tǒng)檢查后，拍攝全頜曲面斷層片、采集上下頜印模，制取模型。

1.3 MSX1 基因檢測(cè)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 人類基因組MSX1 基因序列設(shè)計(jì)。MSX1 基因由2 個(gè)外顯子，引物序列位于外顯子相鄰的內(nèi)含子區(qū)。為避免PCR 擴(kuò)增過程中出現(xiàn)錯(cuò)配，每個(gè)外顯子設(shè)計(jì)2 對(duì)引物。引物序列、擴(kuò)增片段長度見表1。引物由Takara 公司合成。

1.3.2 序列分析 應(yīng)用測(cè)序引物對(duì)家系中所有成員的PCR 產(chǎn)物在ABIPRISM377 自動(dòng)測(cè)序儀上（Takara）進(jìn)行正反向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在DNAstar 軟件中進(jìn)行編輯和比較，并應(yīng)用在線軟件Blastn 與Gen-Bank 人類基因組MSX1 基因序列進(jìn)行對(duì)比分析。

Figure 1 Pedigree of the family圖1 家系圖

2 結(jié) 果

2.1 臨床表型分析

先證者（Ⅲ∶1），女，15 歲，身高1.54 米，體重41 kg，智力正常，左側(cè)完全型唇腭裂，齒槽突裂，下唇瘺；無汗腺、毛發(fā)、指甲等其它外胚層異常?？趦?nèi)及全頜曲面斷層片檢查顯示先天性缺失牙為：右側(cè)下頜恒側(cè)切牙、尖牙、第二前磨牙、第二磨牙、上頜左側(cè)恒側(cè)切牙缺失。滯留乳牙為下頜右側(cè)第二前磨牙（圖2a～2c）。先證者父親（Ⅱ∶1），男，38歲。身高1.73 米，體重66 kg。智力正常，無汗腺、毛發(fā)、指甲等其它外胚層異常?？趦?nèi)及全頜曲面斷層片檢查顯示先天性缺失牙為：兩顆下頜側(cè)切牙（圖2d、2e）。先證者的母親和兄弟表型正常，直系三代親屬未有類似畸形。

2.2 PCR 擴(kuò)增

以基因組DNA 為模板，以MSX11aF/MSX11aR、MSX11bF/MSX11bR、MSX12aF/MSX12aR、MSX12bF/MSX12bR 為引物的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在約277 bp、287 bp、333 bp、419 bp處出現(xiàn)清晰的陽性擴(kuò)增帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。

2.3 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物DNA 序列結(jié)果顯示，患者Ⅱ：1和Ⅲ：1 的MSX1 第二外顯子出現(xiàn)雙峰（圖4），ivs2＋68C ＞T，rs1095。其余序列與人類基因組結(jié)果相同。數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）。該變異在數(shù)據(jù)庫中顯示檢出率為0.02021，檢出頻率較低，在對(duì)照組中沒有檢出。

表1 MSX1 基因第1～2 外顯子引物序列及擴(kuò)增片段長度Table 1 MSX1 primer sequences and amplified fragment length

Figure 2 Dentition photo,panoramic radiograph and facial photo of the patient Ⅲ：1 and Ⅱ：1圖2 患者Ⅲ：1 和患者Ⅱ：1 臨床照片和全景片

Figure 3 PCR amplification of complete exon of MSX1 gene圖3 MSX1 基因完整外顯子的PCR 擴(kuò)增

3 討 論

此家系是研究VWS 家系時(shí)9 號(hào)家系；在家系9中，有2 個(gè)有口腔表型的成員，Ⅱ：1 僅下頜恒側(cè)切牙缺失2 顆，Ⅲ：1 的下頜右側(cè)側(cè)切牙、尖牙、第二前磨牙、第二磨牙（恒牙）和左上側(cè)切牙共5 顆牙缺失，伴有左側(cè)完全型唇腭裂，齒槽突裂和下唇瘺。而在VWS 致病基因IRF6 基因測(cè)序中，未發(fā)現(xiàn)患者Ⅱ：1 有 突 變，而 患 者Ⅲ：1 有 突 變：CC5.6GT（Ala2Gly）；據(jù)此排除患者Ⅱ：1 為VWS 患者，其表型為另外一種遺傳性疾病的表現(xiàn)：先天性少數(shù)牙缺失。雖然國際上報(bào)道的VWS 患者缺牙比例較高，但在本系列研究所有37 例VWS 患者中，除Ⅲ：1，僅有一個(gè)缺牙患者（VWS4Ⅱ：7，左上頜側(cè)切牙缺失），先天缺牙的患病率僅與正常人群的幾率相當(dāng)，推測(cè)可能先天缺牙在我國并不是VWS 綜合征的表型。據(jù)此推斷VWS9 中Ⅱ：1 和Ⅲ：1 出現(xiàn)的先天缺牙為非綜合征性先天缺牙，此家系同時(shí)也是一個(gè)非綜合征性先天缺牙家系；由于缺牙數(shù)少于6顆，診斷為非綜合征性少數(shù)牙先天缺失。非綜合征性少數(shù)牙先天缺失與MSX1 基因突變或缺失有關(guān)。本研究對(duì)VWS9 家系患者檢測(cè)出MSX1 ivs2＋68C＞T 變異，檢索發(fā)現(xiàn)為多態(tài)。其他正常人員未見此多態(tài)。

Figure 4 VWS9 MSX1 exon 2 partial sequencing diagram圖4 VWS9 MSX1 外顯子2 部分測(cè)序圖

基因同源異型盒基因（Homeobox genes）為細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，編碼在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)顱面及肢體形態(tài)發(fā)育。MSX1 為其主要成員之一，在多種組織中的表達(dá)，主要集中于發(fā)育的早期階段，與組織、器官空間位置的確定和形態(tài)形成密切相關(guān)；人類MSX1 基因位于第4 對(duì)染色體4p16.3～16.1，由2 個(gè)外顯子，編碼297 個(gè)氨基酸，在人類，MSX1 基因突變可引起：先天缺牙、非綜合征性唇腭裂等遺傳性疾病，主要表現(xiàn)為恒牙列先天性發(fā)育不全、唇腭裂、趾尖發(fā)育不全。多項(xiàng)研究表明，牙發(fā)育相關(guān)基因的SNP 可能與先天性牙缺失有關(guān)［13，15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)兩例患者M(jìn)SX1 基因中的ivs2＋68C ＞T 多態(tài)，在正常對(duì)照組未篩查到；僅在兩例患者中發(fā)現(xiàn)；患者的表型可能與此多態(tài)相關(guān)。為什么多態(tài)性位點(diǎn)能夠引起與突變相似的表現(xiàn)，分析原因如下：基因多態(tài)性可以使基因的轉(zhuǎn)錄水平或活性增強(qiáng)或降低、改變遺傳密碼、啟動(dòng)子的突變及非轉(zhuǎn)錄區(qū)的突變、導(dǎo)致蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失等。

不同基因突變引起不同的牙齒缺失類型一直是一個(gè)感興趣的話題；將牙缺失分為下前牙缺失和非下前牙缺失［13］?；颊撷颍? 為兩顆下中切牙缺失，Ⅲ：1 的下頜右側(cè)側(cè)切牙、尖牙、第二前磨牙、第二磨牙和左上側(cè)切牙缺失，缺牙較多，兩個(gè)患者檢測(cè)到的遺傳背景的區(qū)別在于Ⅲ：1 是VWS 患者，已檢測(cè)到IRF6 基因突變CC5.6GT（Ala2Gly）；IRF6 基因在角質(zhì)細(xì)胞的遷移、上皮細(xì)胞的分化以及調(diào)控顱面部發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用；對(duì)于患者Ⅲ：1的癥狀，唇腭裂、下唇瘺、牙缺失；唇腭裂、下唇瘺主要是由于IRF6 基因突變；其中缺失牙也不排除與IRF6 基因突變有關(guān)，唇腭裂患者的非缺隙區(qū)缺牙［17］發(fā)病率高；MSX1 多態(tài)可能對(duì)此患者缺牙有協(xié)同作用。家系中兩個(gè)患者表型不同，第二個(gè)解釋則是環(huán)境因素。人體是一個(gè)復(fù)雜的開放系統(tǒng)，當(dāng)一個(gè)人接觸了有害因素后，其不同的細(xì)胞、組織和器官都可能影響基因的表達(dá)。因此，牙齒的發(fā)育異?？梢酝瑫r(shí)反映出環(huán)境和全身系統(tǒng)的不協(xié)調(diào)。許多環(huán)境因素如放射線、化療藥物都可以影響牙齒的發(fā)育［18］。通過以上可以解釋為什么基因的多態(tài)位點(diǎn)可以表現(xiàn)出明顯的牙齒缺失，但缺失的牙位、數(shù)量不同。

考慮到人類牙齒發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜性，因此，患者的遺傳病因不一定僅是這個(gè)MSX1 的多態(tài)，可能存在其他目前未知的新變異，也在患者牙齒和面部發(fā)育異常中起到了輔助作用。由于本研究僅研究了一個(gè)最可能的先天缺牙致病基因MSX1；隨著技術(shù)的發(fā)展，可考慮使用全外顯子測(cè)序技術(shù)［19］，對(duì)其他可能的涉及到面部及牙齒發(fā)育的基因進(jìn)行檢測(cè)。必要時(shí)做基因功能研究。