周佳琦， 舒林徑， 熊毅， 張藝馨， 向琳， 伍穎穎

1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川 成都（610041）； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，重慶（400016）； 3.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院種植科，四川 成都（610041）

糖尿病發(fā)病率居高不下且逐年上升，中國(guó)的成人群體中，估計(jì)糖尿病總患病率為10.9%，而前驅(qū)糖尿病患病率達(dá)35.7%［1-2］。越來(lái)越多的患者面臨著由此帶來(lái)的骨量減少、骨質(zhì)疏松、感染等并發(fā)癥的困擾，其主要通過(guò)血糖升高導(dǎo)致相應(yīng)的病理變化［3］。研究證實(shí)高糖血癥導(dǎo)致鈣伴隨著糖尿流失，并干擾了維生素D 的代謝而導(dǎo)致鈣吸收障礙；另一方面，高血糖可刺激單核細(xì)胞分泌TNF-α 和IL-6 等炎癥因子，增加骨吸收［4］；同時(shí)，高糖環(huán)境會(huì)直接抑制成骨細(xì)胞的功能，并加重破骨細(xì)胞引起的骨吸收，從而減少新骨生成，影響骨的愈合，導(dǎo)致骨組織微結(jié)構(gòu)的破壞［5］。由此，眾多學(xué)者認(rèn)為正是高糖血癥影響了糖尿病患者的骨代謝［6］。頜骨亦可出現(xiàn)骨代謝異常［7］，如發(fā)生牙槽骨喪失及牙周病變，甚至導(dǎo)致牙列缺損或牙列缺失。大量研究證實(shí)，糖尿病會(huì)延緩種植體周的骨改建過(guò)程，干擾種植體周?chē)墙Y(jié)合，甚至導(dǎo)致種植體松動(dòng)失?。?］。因而，糖尿病曾是人工牙種植的相對(duì)禁忌證。如何改善糖尿病患者的骨代謝受到了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。1，25 二羥基維生素D3（1 alpha，25-dihydroxy-cholecalcifero，1，25（OH）2D3）是維生素D（vitamin D，Vit D）的生物活性形式，由類(lèi)固醇受體家族中的維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）介導(dǎo)［9］，調(diào)控全身鈣和磷酸鹽的水平，促進(jìn)成骨和維持人體內(nèi)骨量［10］。Vit D 可雙向調(diào)節(jié)骨的合成和分解，在骨吸收和骨重塑之間的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中起到重要作用［11］。越來(lái)越多研究提出，適當(dāng)補(bǔ)充Vit D 能夠促進(jìn)牙周骨組織的礦化，抑制牙槽骨的吸收。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)Vit D 除了其傳統(tǒng)的成骨調(diào)節(jié)作用外，還與心血管疾病、肥胖和糖尿病等疾病的發(fā)生有關(guān)。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均證實(shí)，Vit D 與糖尿病發(fā)生之間關(guān)系密切。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)，單純胰島素治療，能一定程度上改善糖尿病大鼠種植體周骨組織形成和礦化，但其水平仍較正常狀態(tài)低。而聯(lián)合使用1，25（OH）2D3可以增強(qiáng)胰島素的作用效果，使糖尿病大鼠的種植體穩(wěn)定性和種植體-骨結(jié)合率增加，接近正常[12]。叉頭轉(zhuǎn)錄因子-1（forkhead transcription factor 1，F(xiàn)oxO1）是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族中最先被發(fā)現(xiàn)且被廣為研究的成員，在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。隨著對(duì)骨組織的深入研究，發(fā)現(xiàn)除了β 細(xì)胞和肝細(xì)胞之外，骨組織對(duì)葡萄糖的代謝也起著調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀測(cè)1，25（OH）2D3作用于高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞功能、成骨細(xì)胞中FoxO1 的表達(dá)變化，初步探究糖尿病的典型特征——高糖血癥影響骨代謝的可能途徑和1，25（OH）2D3對(duì)其潛在的治療機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

倒置熒光相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；ABI7300 實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀（Ambion 公司，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（BD 公司，美國(guó)）；MC3T3-E1 成骨細(xì)胞系（ATCC，美國(guó)）；1，25（OH）2D3（Sigma 公司，美國(guó)）；低糖DMEM 培養(yǎng)基（5.5 mmol/L）、高糖DMEM 培養(yǎng)基（22 mmol/L）（Hyclone 公司，美國(guó)）；胰蛋白酶（Gibco 公司，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)）；FoxO1 一抗（Santa Cruz 公司，美國(guó)）；免疫熒光二抗（Life Technologies 公司，美國(guó)）；茜素紅（Sigma 公司，美國(guó)）；CCK-8 試劑盒（Dojindo 公司，日本）；Annexin V，F(xiàn)ITC 凋亡檢測(cè)試劑盒（同仁公司，日本）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo 公司，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞系及分組

本研究細(xì)胞選用MC3T3-E1 成骨細(xì)胞系。復(fù)蘇細(xì)胞，用含10%FBS，1%雙抗低糖DMEM 的培養(yǎng)基，于37 ℃下5%CO2孵箱培養(yǎng)。

共設(shè)置3 組，對(duì)照組：低糖（5.5 mmol/L）DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖組：高糖（22 mmol/L）DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖+1，25（OH）2D3組：高糖DMEM+1，25（OH）2D3培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞，用低糖DMEM（5.5 mmol/L）配制成1 × 105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中，靜置培養(yǎng)4 h，直至大部分成骨細(xì)胞貼壁后，按分組分別更換相應(yīng)培養(yǎng)基，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。在37 ℃培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，吸棄培養(yǎng)液，加入CCK-8 與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的混合液。標(biāo)記空白孔，在其中滴入同樣的混合液作為空白對(duì)照。置于培養(yǎng)箱孵育中4 h 后取出。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度。按如下公式計(jì)算細(xì)胞增殖活力：細(xì)胞增殖活力＝（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞，配置1 × 106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，滴加于6 孔板中，分組培養(yǎng)48 h。收集上清部分，用PBS 洗細(xì)胞2 次，收集洗滌液。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入2% BPS 防止消化過(guò)度。將消化后的懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入收集的上清液和洗滌液，1 000 rpm 離心3 min，棄掉上清部分，重復(fù)2 次。加入1 × Annexin V Binding Solution，制備細(xì)胞懸液，加入Annexin V/FITC 結(jié)合物、PI Solution，室溫下避光培養(yǎng)15 min，加入1×Annexin V Binding Solution。細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，加樣到流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞分化檢測(cè)

取培養(yǎng)至第三代的成骨細(xì)胞以1 × 105個(gè)/mL的密度接種于24 孔板中，24 h 后更換終濃度為含10 mmol/L 的β-甘油磷酸鈉與50 μmol/L 抗壞血酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行分組培養(yǎng)，每隔2～3 d 換液1次。培養(yǎng)19 d 后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞聚集成不透明區(qū)域，呈結(jié)節(jié)樣時(shí)，即可用PBS 漂洗兩次，再用無(wú)水乙醇固定10 min，0.1%茜素紅染色，置于37 ℃孵箱中作用30 min。去除非特異結(jié)合后，10%氯化十六烷基吡啶共孵育15 min 脫色，在562 nm 處測(cè)量吸光度。

1.6 檢測(cè)FoxO1蛋白表達(dá)及其與細(xì)胞核的位置關(guān)系

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞，配置1 × 105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于24 孔板中，分組培養(yǎng)1 d 后取出。 PBS 洗滌5 min × 3 次，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，加入0.25%Triton 室溫放置10 min，PBS 洗滌5 min × 3 次；加入4%BSA 封閉30 min，PBS 洗滌2次；加入FoxO1 一抗，濕盒中37 ℃孵育60 min 后，4 ℃過(guò)夜；PBS 洗滌5 min × 3 次，吸干孔板內(nèi)液體，滴加PBS 1∶100 稀釋的生物素化二抗，濕盒37 ℃孵育60 min，棄干凈液體，PBS 洗滌5 min × 3 次。DAPI 1∶1 000 染色5 min，放置于熒光顯微鏡下采集圖像。每組兩個(gè)復(fù)孔，200 倍視野下，分別選取左側(cè)上、左側(cè)下、右側(cè)上、右側(cè)下、正中5 個(gè)視野進(jìn)行圖像采集。利用image-pro plus 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 檢測(cè)FoxO1 的mRNA 表達(dá)

Trizol 法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），參照試劑說(shuō)明書(shū)上機(jī)進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。根據(jù)Genebank提供的基因序列設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)oxO1 基因設(shè)計(jì)內(nèi)參GAPDH，得出每組的Ct 值，采用2-△△Ct 表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)量/對(duì)照組基因表達(dá)量的倍數(shù)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因名稱(chēng)以及qRT-PCR 的引物序列Table 1 Names of genes and primer sequences for qRT-PCR

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示所得數(shù)據(jù)，采用SPSS13.0軟件包統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)結(jié)果。采用單因素方差分析及LSD 法處理所得數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 1，25（OH）2D3抑制高糖引起的細(xì)胞異常增殖

采用CCK-8 試劑盒分析高糖環(huán)境和高糖+1，25（OH）2D3對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力的影響。檢測(cè)結(jié)果表明，高糖環(huán)境可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而1，25（OH）2D3能夠逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，培養(yǎng)48 h 后各組細(xì)胞增殖能力出現(xiàn)顯著差異（F＝22.589，P＝0.002），72 h 后組間差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝21.401，P＝0.002）。培養(yǎng)48 h 和72 h 后，高糖組成骨細(xì)胞增殖活力均強(qiáng)于對(duì)照組（P＜0.05）；高糖環(huán)境加入1，25（OH）2D3后，細(xì)胞增殖受到抑制，48 h 和72 h 時(shí)均低于高糖組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。

Figure 1 Proliferation of osteoblasts圖1 成骨細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

2.2 1，25（OH）2D3 減少高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的凋亡

通過(guò)Annexin V/PI 雙染，測(cè)定細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明高糖環(huán)境下，細(xì)胞凋亡明顯增加（尤其是凋亡早期細(xì)胞），在加入1，25（OH）2D3后，細(xì)胞凋亡有所減少（圖2）。

Figure 2 Flow cytometry analysis of apoptosis圖2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果（Annexin/PI 雙染）

2.3 1，25（OH）2D3逆轉(zhuǎn)高糖引起的成骨分化抑制

分組培養(yǎng)19 d 后，通過(guò)鈣結(jié)節(jié)測(cè)定細(xì)胞分化情況。倒置相差顯微鏡下觀察，可見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，生長(zhǎng)密集，局部細(xì)胞聚集成團(tuán)，形成多個(gè)大小不等，圓形的礦化結(jié)節(jié)。茜素紅染色時(shí)見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)呈紅染，不透明狀，有的礦化結(jié)節(jié)之間相互融合，如圖3a。高糖組鈣結(jié)節(jié)大小、面積顯著減少，而加入1，25（OH）2D3后，成骨細(xì)胞能夠分泌更多的礦化基質(zhì)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯增加。茜素紅半定量結(jié)果顯示（圖3b），3 組礦化基質(zhì)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝22.175，P＝0.002）。高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞內(nèi)礦化基質(zhì)減少（P＜0.01）；1，25（OH）2D3能夠逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)，提高礦化物含量（P＜0.01），但仍略低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 1，25（OH）2D3促進(jìn)FoxO1 核外轉(zhuǎn)移

對(duì)照組細(xì)胞平均74.6 個(gè)/視野，高糖組平均110.4 個(gè)/視野，高糖+1，25（OH）2D3組平均57.4 個(gè)/視野。細(xì)胞數(shù)目高糖+1，25（OH）2D3組＜對(duì)照組＜高糖組，與CCK-8 結(jié)果趨勢(shì)一致。

免疫熒光染色觀察FoxO1 分布（圖4a）：低糖環(huán)境下，細(xì)胞核內(nèi)外均可見(jiàn)綠色熒光，部分細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核的周?chē)哂懈吡翢晒鈼l帶，顯示FoxO1 細(xì)胞核外表達(dá)量較細(xì)胞核內(nèi)多。在高糖環(huán)境下，細(xì)胞核外高亮熒光帶消失，F(xiàn)oxO1 細(xì)胞核內(nèi)外表達(dá)量相近。加入1，25（OH）2D3組后，細(xì)胞核內(nèi)FoxO1 的綠色熒光顯著減弱，細(xì)胞核外呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光帶，顯示FoxO1 主要分布于細(xì)胞核外。

對(duì)每組的5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，各組細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)FoxO1 的細(xì)胞比例具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝170.921，P＜0.001）（圖4b），高糖組細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)FoxO1 的細(xì)胞比例顯著高于其他兩組（P＜0.01）。

2.5 1，25（OH）2D3減少FoxO1 mRNA 表達(dá)培養(yǎng)72 h 后，各組FoxO1 mRNA 表達(dá)水平不完全 相同（F＝11.669，P＝0.009）。高 糖組FoxO1 mRNA 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和高糖+1，25（OH）2D3組（P＝0.006），而對(duì)照組和高糖+1，25（OH）2D3組之間無(wú)明顯差異（圖5）。

3 討 論

高糖環(huán)境可顯著影響細(xì)胞活性氧的功能，增加成骨細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平［13］，從而導(dǎo)致成骨細(xì)胞內(nèi)異常增殖增加（P＜0.05）。FoxO1 是成骨細(xì)胞氧化還原平衡的主要調(diào)控因子，當(dāng)高糖誘發(fā)氧化應(yīng)激增加時(shí)可刺激FoxO1 分泌［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下FoxO1 基因表達(dá)增加，蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)oxO1 轉(zhuǎn)錄活性增加。Wnt/β-catenin 通路參與骨代謝的調(diào)控，激活后能夠促進(jìn)成骨分化、抑制成骨細(xì)胞凋亡。同時(shí)，β-catenin 也是FoxO1 的轉(zhuǎn)錄激活因子。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，F(xiàn)oxO1 與Wnt 通路競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合β-catenin［15］，從而抑制Wnt 信號(hào)，導(dǎo)致成骨分化受到抑制、凋亡增加。

Figure 3 Mineralized nodule formation of osteoblasts by alizarin red staining圖3 成骨細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色結(jié)果

Figure 4 The distribution of FoxO1 protein in osteoblasts shown by immunofluorescence staining圖4 FoxO1 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況免疫熒光染色結(jié)果

在高糖環(huán)境下，1，25（OH）2D3通過(guò)阻止FoxO1入核，抑制了FoxO1 的功能。這與之前Zhang 等在非高糖環(huán)境下的研究結(jié)果相符［16］，1，25（OH）2D3通過(guò)PI3K 和AKT 信號(hào)通路調(diào)控FoxO1，使其磷酸化后阻止其向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，使得FoxO1 的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)［17］。因此加入1，25（OH）2D3后，F(xiàn)oxO1 與Wnt 通路競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合減少，Wnt 通路促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化、抑制凋亡的作用得以體現(xiàn)。此外，1，25（OH）2D3抑制凋亡的作用也可能與Fas 通路相關(guān)［18］。當(dāng)FoxO1功能受到抑制時(shí)，MnSOD 等抗氧化酶產(chǎn)生減少，成骨細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平提高，異常增殖的趨勢(shì)理論上會(huì)更明顯。而本研究發(fā)現(xiàn)1，25（OH）2D3抑制高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的異常增殖，可能有其他信號(hào)分子參與了這一調(diào)控過(guò)程。綜上所述，高糖環(huán)境會(huì)增加成骨細(xì)胞異常增殖和凋亡，抑制細(xì)胞分化。1，25（OH）2D3可能通過(guò)降低高糖環(huán)境中成骨細(xì)胞中FoxO1 mRNA 表達(dá)，阻止FoxO1 向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞的異常增殖、凋亡，促進(jìn)成骨分化，影響成骨細(xì)胞的功能。