潘慧芳

（清遠(yuǎn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 511500）

非洲豬瘟 （African swine fever，ASF） 是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度傳染性疾病。 該病病程短，死亡率高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害甚大，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病之一，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。ASFV 可感染家豬、野豬和軟蜱，是唯一一種節(jié)肢動(dòng)物作為傳播媒介的DNA 病毒。 家豬感染后的臨床表現(xiàn)和病理變化以及流行病學(xué)特點(diǎn)類似于急性豬瘟，但更為急劇，以全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征，致死率高達(dá)100%[1]。2018 年8 月，遼寧省沈陽(yáng)市確診我國(guó)首例非洲豬瘟，至今全國(guó)所有省份都已出現(xiàn)非洲豬瘟疫情[2],對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前， 各級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室主要采用熒光定量PCR 開展ASFV檢測(cè)工作。 但在日常工作中，常常出現(xiàn)假陽(yáng)性、陽(yáng)性對(duì)照或陽(yáng)性樣品不顯示Ct 值和檢測(cè)樣品無(wú)典型“S”形擴(kuò)增曲線但其Ct 值顯示為陽(yáng)性等問題。 筆者通過查閱大量文獻(xiàn)以及結(jié)合平時(shí)的工作經(jīng)驗(yàn)，分析了上述問題的可能原因和解決方案。

1 熒光定量PCR 檢測(cè)假陽(yáng)性的原因與預(yù)防措施

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]，出現(xiàn)假陽(yáng)性的主要原因有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)功能區(qū)域設(shè)置不合理、檢測(cè)人員、物品流向不合理、實(shí)驗(yàn)人員在核酸提取與試劑配制時(shí)未在獨(dú)立的生物安全柜中進(jìn)行、 實(shí)驗(yàn)人員操作不規(guī)范以及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清潔消毒不徹底等。 針對(duì)上述問題，應(yīng)從實(shí)驗(yàn)室布局、檢測(cè)人員自身和實(shí)驗(yàn)室生物安全方面進(jìn)行改進(jìn)。

1.1 完善實(shí)驗(yàn)室功能分區(qū)

從事分子生物學(xué)檢測(cè)活動(dòng)，微量的核酸污染即可嚴(yán)重影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 在設(shè)計(jì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，必須按照分子生物學(xué)試驗(yàn)的具體要求，將實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格分隔成試劑配制區(qū)、核酸提取區(qū)、 核酸擴(kuò)增區(qū)、PCR 產(chǎn)物分析區(qū)等完全獨(dú)立的功能室，做到對(duì)互不相容活動(dòng)的相鄰試驗(yàn)區(qū)域形成真正有效的隔離， 防止交叉污染的發(fā)生[3]。

1.2 檢測(cè)人員正確規(guī)范操作

從事熒光定量PCR 試驗(yàn)的檢測(cè)人員，必須經(jīng)培訓(xùn)合格后上崗，切實(shí)掌握PCR 檢測(cè)操作原理、方法和步驟，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室建立的檢測(cè)操作規(guī)程和試劑盒操作說明書進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。所有ASFV 檢測(cè)的操作步驟必須在生物安全柜或者負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，處理完畢之后，對(duì)操作臺(tái)面和房間進(jìn)行徹底消毒。 試驗(yàn)人員進(jìn)入各個(gè)操作區(qū)域后，要嚴(yán)格單向移動(dòng)，即試劑配制區(qū)→樣品提取區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆行。

PCR 擴(kuò)增完成后， 盡量避免打開密封反應(yīng)體系。 禁止把PCR 產(chǎn)物帶到配制PCR 體系的區(qū)域內(nèi)， 同時(shí)禁止在配制PCR反應(yīng)體系的區(qū)域內(nèi)，操作含核酸或質(zhì)粒的溶液[3]。

1.3 做好實(shí)驗(yàn)室生物安全

熒光PCR 試驗(yàn)完畢后，必須對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境徹底消毒。 生物安全柜和潔凈工作臺(tái)進(jìn)行紫外照射消毒， 時(shí)間不低于30min，以破壞殘留的核酸； 工作臺(tái)面等用10%次氯酸或75%酒精等消毒液消毒；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的樣本液和擴(kuò)增產(chǎn)物是氣溶膠的主要污染源，故實(shí)驗(yàn)室要經(jīng)常換氣和消毒；所有試驗(yàn)區(qū)域，包括懸掛白大褂位置、放置高速離心機(jī)位置、放置PCR 儀等區(qū)域都要用可移動(dòng)紫外線燈照射30min[2]。

2 熒光定量PCR 的Ct 值和熒光擴(kuò)增曲線異常

在熒光定量PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR 反應(yīng)的進(jìn)行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)， 熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。 每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化， 從而得到熒光擴(kuò)增曲線。 把PCR 反應(yīng)的前6 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)， 熒光閾值的默認(rèn)設(shè)置是2～6 個(gè)循環(huán)本底熒光信號(hào)平均值的12 倍。 樣品的熒光強(qiáng)度超過背景熒光值（熒光閾值）的時(shí)刻所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，叫做Ct 值。

2.1 陽(yáng)性對(duì)照或陽(yáng)性樣品不顯示Ct 值及解決方案

日常檢測(cè)非洲豬瘟樣品時(shí)，常常出現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，但不顯示Ct 值（Ct 值顯示為Undetermined）。 有學(xué)者指出[4]，出現(xiàn)這種情況的主要原因是儀器默認(rèn)的熒光閾值線過高。 解決方案：將熒光閾值一般設(shè)在PCR 指數(shù)擴(kuò)增的起始，并高于陰性對(duì)照曲線。 其數(shù)值選擇與試劑盒的性能有關(guān)，對(duì)熒光強(qiáng)度較高的擴(kuò)增曲線， 閾值的設(shè)定不一定非要遵循固定的原則。 因此，針對(duì)試劑盒性能不同，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的閾值范圍，盡可能保證低值樣本檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性[4]。

2.2 檢測(cè)樣品無(wú)典型“S”形擴(kuò)增曲線，但其Ct 值顯示為陽(yáng)性及解決方案

實(shí)際檢測(cè)過程中，也會(huì)遇到被檢樣品無(wú)典型“S”形擴(kuò)增曲線，但其Ct 值顯示為陽(yáng)性（按照試劑盒說明書Ct 值判定標(biāo)準(zhǔn)）的情況。其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)， 主要是被檢樣品不夠新鮮或經(jīng)反復(fù)凍融等導(dǎo)致的。 因此，被檢樣品要盡量新鮮，4℃～8℃保存的血清或抗凝血樣品一般不超過120 h，唾液樣品、組織樣品凍融次數(shù)一般不超過3 次[4]。