晏子友，萬鳴宏，楊 林，楊蕓琪，黃 偉，沈金峰，羅富里，皮持衡

慢性缺氧是慢性腎臟病病理改變的主要原因之一，在慢性缺氧過程中腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell，RTEC)凋亡會誘發(fā)腎小管壞死，加速慢性腎臟病進展[1-2]。自噬最初描繪成吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解內容物以獲取能量的過程，可能與多種疾病的發(fā)生有關[3-5]。在腎臟病早期機體遠端組織和器官可出現生物學行為改變，在腎臟病患者中肺、心臟均可出現自噬，但機制尚不明確[6]。目前已證實在慢性腎臟病早期即可出現微小核糖核酸(microRNA，miRNA)的差異性表達，miRNA與細胞自噬等多種生物學行為密切相關[7]。外泌體是細胞和臟器傳遞生物學信息的重要媒介，外泌體中含有的miRNA是外泌體干預細胞功能的主要機制，也可能是腎臟細胞溝通遠端臟器的樞紐，可能是腎臟病患者遠端臟器組織自噬的主要原因[8]。該研究采用體外缺氧模型培養(yǎng)RTEC，探討缺氧狀態(tài)下RTEC外泌體中自噬相關miRNA分泌情況。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑大鼠RTEC株(NRK-52E) 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢CCTC公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和 DMEM培養(yǎng)基購自上海賽默飛世爾科技有限公司；miRNA反轉錄試劑盒/PCR試劑盒、cel-miR 39購自北京天根生化科技有限公司、BCA蛋白濃度試劑盒購自北京碧云天生態(tài)園林科技有限公司；ExoQuick-TC 外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司。

1.2 miRNA的生物信息學預測利用mi-croRNA.org、Target Scan、miRanda及PicTar等生物信息學軟件查閱文獻確定將 miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a作為自噬相關miRNA研究對象。

1.3 RTEC干預和外泌體提取缺氧干預與分離外泌體：采用無外泌體的10%FBS培養(yǎng)基分皿接種培養(yǎng)NRK-52E細胞，待細胞融合達60%后換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h同步化，后換含無外泌體1% FBS培養(yǎng)基并分別放入常氧(37 ℃、21%O2、5% CO2)、缺氧(37 ℃、1%O2、5%CO2)培養(yǎng)箱培48 h，收集兩2組細胞培養(yǎng)上清，加入2 ml的 ExoQuick -TC沉淀液，反復顛倒3次使其混勻；冷藏(4 ℃)過夜(12 h)； 10 000 r/min離心ExoQuick-TC 混合液 30 min。離心后外泌體沉淀位于試管底部，呈淺褐色或白色。

1.4 外泌體和細胞蛋白濃度取2組重懸液，據BCA試劑盒說明書操作，最后在562 nm波長處測量各樣品孔吸光度值，根據標準曲線計算外泌體蛋白濃度；同時測定常氧及缺氧RTEC的蛋白濃度，計算外泌體蛋白濃度與細胞蛋白濃度比值。

1.5 RT-PCR檢測腎臟細胞外泌體中miRNA表達量取等蛋白量的常氧及缺氧外泌體各加入5 pmol的cel-miR 39作為外參，根據北京天根試劑盒說明書提取外泌體總RNA，反轉錄并使用實時熒光定量PCR測定miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、 miRNA-183、miRNA-200a的表達量，以上miRNA引物由北京天根公司設計合成。

1.6 外泌體的鑒定采用細胞裂解液處理細胞后離心去上清液為總蛋白，變性后每孔加入30 μg總蛋白行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白BSA室封閉60 min，孵育一抗過夜，加入二抗室溫孵育60 min，掃描成像。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析。兩樣本比較，使用獨立樣本t檢驗；方差齊的多樣本均數的比較使用單因素方差分析，多重比較使用LSD法；方差不齊的多樣本均數的比較使用Welch法，多重比較使用 Dunnetts T3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 缺氧對外泌體基本特征的影響以細胞蛋白為陽性參照，2組重懸后Western blot結果均提示表達外泌體標志性蛋白CD63，見圖1；取離心后沉淀重懸后電鏡下觀察，鏡下常氧和缺氧組囊泡均可見圓形或橢圓形的環(huán)狀結構，有完整的薄膜，直徑在60～150 nm，多個視野對比，均未見明顯異常，見圖2。

圖1 Western blot 檢測細胞外泌體標志物CD63的表達

圖2 2組大鼠外泌體形態(tài)的比較A：常氧組；B：缺氧組

2.2 缺氧對外泌體分泌量的影響隨著時間進展，12、24、48 h常氧組和缺氧組外泌體總蛋白均增加，差異有統(tǒng)計意義，但2組細胞對應時間點分泌的外泌體總蛋白差異無統(tǒng)計學意義；12、24、48 h外泌體總蛋白用對應的細胞蛋白標化，結果顯示12、24 h時缺氧組外泌體/細胞蛋白比值較常氧組無明顯變化，48 h時缺氧組外泌體/細胞蛋白比值相較常氧組高，且差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 缺氧對外泌體分泌量的影響

與對應時間點缺氧組比較：*P<0.05

表2 缺氧對外泌體中自噬相關miRNA表達譜的影響

與對應時間點缺氧組比較：*P<0.05

2.3 缺氧對外泌體中自噬相關miRNA表達量的影響缺氧組患者血清中miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a水平明顯增高，而且高于常氧組，差異有統(tǒng)計學意義，而常氧組miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a含量無明顯變化，見表2。

3 討論

缺氧是急慢性腎臟病患者的主要病理生理機制之一。越來越多的研究[9-11]證實急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)甚少單獨發(fā)生，并且腎損傷與遠端臟器(肺、肝、心、腦、消化道、骨髓)等之間存在復雜的交互作用。本研究在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)腎小管上皮模擬AKI過程中腎臟細胞缺血缺氧的過程，通過標準化檢測后發(fā)現缺氧環(huán)境下腎臟細胞分泌外泌體的量明顯增多，并且隨著缺氧時間的延長，外泌體的含量逐漸上升。這可能是細胞對外環(huán)境改變釋放的一種信號。

自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現象，是生物在發(fā)育、衰老的過程中存在的一個消除自身多余或者受損細胞器以及維持細胞穩(wěn)態(tài)的共同機制[12]。 在急慢性腎臟病疾病模型中心臟、肺、肌肉多數遠端臟器和組織均存在自噬的現象[13]。目前腎臟病患者遠端臟器功能改變的具體機制尚不完全明確，可能與細胞炎癥因子浸潤、尿毒癥毒素侵襲有關，此外遺傳信息的傳遞可能在遠端臟器行為改變中存在重要的臨床意義[14-15]。外泌體是細胞分泌的囊泡，攜帶多種生物學信息，是溝通遠端細胞的主要媒介，可能參與急慢性腎損傷中遠端臟器功能損傷。當AKI發(fā)生時腎臟細胞分泌大量miRNA，這些miRNA由外泌體包裹并被釋放入血，可能對遠端臟器、細胞生物學行為造成影響。本研究建立體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞模型，定量檢測自噬相關miRNA表達量的影響，結果證實隨著缺氧時間的延長外泌體中miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-214、miRNA-183、miRNA-200a發(fā)現了顯著變化，這意味著細胞外環(huán)境改變可能導致細胞外泌體中miRNA表達譜改變，進而可能影響細胞的生物學行為，通過進一步分析不同缺氧時間段患者miRNA表達譜的關系，結果提示隨著缺氧時間的延長，miRNA表達量明顯上升。提示外泌體中miRNA表達與腎臟病變的程度密切相關，而此類miRNA在外泌體的包裹下可能導致影響遠端臟器的行為，干預機體重要臟器的生物學行為，這可能是腎臟病早期遠端臟器發(fā)生適應性變化的重要原因。

本研究關注的是外泌體中miRNA表達譜在缺氧時量的上升與腎臟疾病重要臟器的自噬行為有一定程度關聯，但是否還有血液中其他因素的影響，還有待于進一步研究。

綜上所述，缺氧可以影響腎臟細胞外泌體的分泌，影響外泌體的量和外泌體中包裹的miRNA的表達，缺氧環(huán)境下證實外泌體中自噬相關miRNA表達均明顯上調，缺氧環(huán)境下RTEC外泌體中自噬相關miRNA表達上調可能參與重要臟器的生物學行為，這為進一步研究慢性腎臟病患者重要臟器自噬行為奠定了堅實的基礎。