郭延華,徐方野，李迎利，張譯元，王立民，唐 紅，皮文輝，周 平

(1.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832000;2 .石河子市獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫所，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】自從克隆動(dòng)物多莉羊[1]誕生以來，相繼有17種克隆動(dòng)物[2-3]出現(xiàn)。目前克隆技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于家畜育種，但效率低下制約著克隆技術(shù)的應(yīng)用，這種效率的低下是由供核細(xì)胞不完全重編程和胚胎發(fā)育異常引起的。在眾多影響克隆效率的因素當(dāng)中，核供體細(xì)胞作為一種關(guān)鍵因素，不僅在類型，年齡，狀態(tài)和細(xì)胞周期方面對克隆效率產(chǎn)生巨大的影響[4]，而且制作克隆動(dòng)物的原代細(xì)胞和從克隆動(dòng)物身上取得繼代細(xì)胞在克隆效率方面也存在差異[5]。這種差異是由供核細(xì)胞表觀遺傳差異引起的，成纖維細(xì)胞作為核移植供核的常用細(xì)胞，對其進(jìn)行優(yōu)化選擇與處理在進(jìn)行克隆顯得十分必要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】成纖維細(xì)胞的選擇除了上述方面的差異之外，在不同個(gè)體之間也有較大差異[6]，但綿羊依據(jù)品種有肉用、毛用、乳用方面的差異，這種差異是否會(huì)引起克隆效率的差異尚未可知。在同一供體方面，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與原代細(xì)胞在克隆效率方面是否有差異比較有爭議[7-8]，但應(yīng)用基因編輯技術(shù)篩選獲得的同一供體細(xì)胞多個(gè)克隆株之間在克隆效率方面的差異尚未可知。成纖維細(xì)胞傳代次數(shù)高并不利于克隆，而傳代次數(shù)低因個(gè)各實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范不同就造成克隆效率差異較大，因此傳代次數(shù)的多少與匯合法抑制時(shí)間上的處理對克隆效率影響就不得而知?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期研究發(fā)現(xiàn)供核細(xì)胞膜的貼壁特性對重構(gòu)胚融合效率有很大影響[9]，并未獲得較為充分的胚胎發(fā)育數(shù)據(jù)。研究從供核細(xì)胞的靜置時(shí)間與狀態(tài)，傳代次數(shù)與匯合期生長時(shí)間，相同來源個(gè)體和不同來源個(gè)體細(xì)胞株之間進(jìn)行比較，優(yōu)化供核細(xì)胞的處理與選擇?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從供核細(xì)胞的靜置時(shí)間，研究傳代次數(shù)與周期處理，供核細(xì)胞不同克隆株，不同羊源細(xì)胞等，以重構(gòu)胚融合率和囊胚發(fā)育率為檢測指標(biāo)，判定單因素供核細(xì)胞對克隆胚胎的影響。為獲得更多數(shù)量的克隆胚胎材料奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試劑除特別說明外，均為日本和光藥業(yè)株式會(huì)社藥品。M199 (GIBCO)，、DMEM (GIBCO)、FCS (Hyclone)，胰酶替代物 (Gbico)，四孔板 (NUNC)，60 mm 培養(yǎng)皿(NUNC)，顯微操作針(Narishige)，石蠟油(Sigma M8410)，體式顯微鏡(Nikon SMZ800)，拉針儀 (NARISHIGE PN-30)，磨針儀(NARISHIGEEG-400)，煅燒儀(NARISHIGE MF-900)，顯微操作儀 (Eppendorf Transferman NK2)，CO2培養(yǎng)箱(New Branswick Galaxy 170S)，融合儀(Voltain EP-1 Australia)，0.5 mm 融合槽(BTX)。

1.2 方 法

1.2.1 卵母細(xì)胞的采集

從新疆石河子市活畜屠宰場收集綿羊卵巢，投入生理鹽水中，用0.4 L 保溫壺收集卵巢后 0.5～3 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。室溫平衡30 min 后，清洗1次后剪去輸卵管連接部及多余的結(jié)締組織，用生理鹽水再清洗3～4 次，供采卵用。刺剖法采集：簡述如下，卵巢瀝干放入加好采卵液(M199+0.1% BSA+0.1 mg/mL 肝素+0.1 mg/mL慶大霉素)的100 mm 培養(yǎng)皿中，左手持尖頭眼科鑷子將卵巢固定在采卵液中，右手持手術(shù)刀片將突出卵巢皮質(zhì)、明亮的卵泡刺破并多剖數(shù)刀使其進(jìn)入采卵液中，采完的卵巢在采卵液中輕輕晃動(dòng)防止黏附。沉淀數(shù)分鐘后棄去上清液，用手拉巴氏管在體式顯微鏡下選取形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexs，COCs)進(jìn)行成熟。

1.2.2 卵母細(xì)胞的成熟與處理

將采集到的COCs 用采卵液清洗2～3 遍，然后用成熟液清洗1～2 遍，放入預(yù)平衡2 h 的四孔板成熟液中 (M199+15% FBS+0.1 IU/mL FSH+0.2 IU/mL LH+1.0 μg/mL 雌二醇)，培養(yǎng)密度80 枚/mL，培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2、飽和濕度。體外成熟18 h 后，將擴(kuò)散的顆粒細(xì)胞用移液器吹打除去，0.1%透明質(zhì)酸酶消化1 min 后繼續(xù)吹打以除盡顆粒細(xì)胞，用成熟液清洗2～3 次，移入預(yù)先平衡于60 mm平皿的成熟培養(yǎng)滴中，在體式顯微鏡下挑出排有第一極體的成熟卵母細(xì)胞以備用。

1.2.3 供體成纖維細(xì)胞的處理

用刀片剔除綿羊耳部邊緣的絨毛，75%酒精棉球擦洗耳組織2～3 次，棉片“C”包埋耳源消毒30 sec后，用取樣鉗夾取耳組織投入生理鹽水 (含 200 IU/mL 青霉素和220 μg/mL 鏈霉素)中帶回實(shí)驗(yàn)室(運(yùn)輸時(shí)間：東弗里生羊 6 h 、黑頭薩?？?2 h 、哈薩克羊 2 h 、澳洲白 24 h 、白頭薩?？?6 h )，移入超凈臺(tái)用眼科剪和鑷子剔除軟骨組織，生理鹽水清洗4～5 次，再投入75%酒精中浸15～20 s，生理鹽水清洗2～3次，移入30 mm 平皿中剪碎耳部皮膚組織，組織塊法培養(yǎng)在30 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為DMEM 加15% FBS。原代培養(yǎng)3～5 d后觀察組織塊貼壁和成纖維細(xì)胞遷出情況，每隔2 d換液1次。待原代成纖維細(xì)胞生長至80%～90%連成片后，用胰酶替代物消化3～5 min，用含15% FBS的DMEM 培養(yǎng)液 (含EGF 10 ng/mL，IGF10 ng/mL)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2 d 換液1次，傳1～2代之后凍存?zhèn)溆谩?/p>

供體細(xì)胞的靜置狀態(tài)與處理：在前期的研究中[9]，發(fā)現(xiàn)在15 min內(nèi)有30%以上的細(xì)胞發(fā)生貼壁行為具有較好的融合性。為了進(jìn)一步規(guī)范核移植操作，發(fā)現(xiàn) 15～30 min 內(nèi)的供核細(xì)胞發(fā)生輕度的貼壁行為，而靜置時(shí)間在 2 h 左右的供核細(xì)胞有超過50%以上的貼壁行為。在此區(qū)分細(xì)胞靜置狀態(tài)并設(shè)置分組，15～30 min 內(nèi)更換1次供核細(xì)胞的處理稱為懸浮組，而 2 h 左右更換1次供核細(xì)胞的處理稱為貼壁組。

供體細(xì)胞的傳代與匯合抑制處理：將供體細(xì)胞解凍后，3 d后生長匯集至90% 以上進(jìn)行1次傳代，依據(jù)試驗(yàn)要求將解凍后代供體細(xì)胞進(jìn)行1、2、3次傳代，細(xì)胞生長到平臺(tái)抑制期24和48 h 收集，200 μL培養(yǎng)液重懸浮供體細(xì)胞，4℃保存以備用。

供體細(xì)胞單克隆株挑選：將供體細(xì)胞用胰酶替代物進(jìn)行消化3 min，輕拍或圓周運(yùn)動(dòng)晃動(dòng)30 mm培養(yǎng)皿，使供體細(xì)胞脫離皿底漂浮，超過消化時(shí)間(3～5 min)的供核細(xì)胞丟棄。吸出漂浮的細(xì)胞2 500 r/mim離心收集至1.5 mL EP管，100 μL 懸浮，用含10%胰酶替代物的PBS清洗液懸浮少量細(xì)胞并晃動(dòng)均勻，以體式顯微鏡能夠觀察到松散分離的單個(gè)供體細(xì)胞為準(zhǔn)，貼壁的細(xì)胞放棄種植單克隆。在超凈臺(tái)內(nèi)的體視顯微鏡下，用口吸巴士玻璃管挑取表面光滑圓潤的單克隆細(xì)胞，然后種入96孔板，培養(yǎng)皿中含有100 μL 15%FBS的DMEM培養(yǎng)液，3 d換液1次，觀察細(xì)胞直至長滿進(jìn)行收集。

1.2.4 卵母細(xì)胞與供核細(xì)胞的重構(gòu)

用60 mm 培養(yǎng)皿制作操作液(M199+25 mmol/L Hepes+20% FBS) 并覆蓋石蠟油，移入顯微操作臺(tái)將注射針與固定針移入操作視野內(nèi)。將受體卵母細(xì)胞用含7.5 μg/mL CB 的成熟液培養(yǎng)10 min，用巴氏管將供體細(xì)胞和卵母細(xì)胞移入操作液中進(jìn)行盲吸去核，固定針吸住卵母細(xì)胞，第一極體指向12 點(diǎn)方向，去核針刺入剜除極體及周圍少量細(xì)胞質(zhì)，吐出卵母細(xì)胞質(zhì)，吸取供體細(xì)胞放入11 點(diǎn)方向。

1.2.5 融合、激活與培養(yǎng)

將重構(gòu)的卵母細(xì)胞-供核細(xì)胞復(fù)合體放入成熟液中恢復(fù)30 min 后，移入融合液中平衡2 min，然后把卵子放入覆蓋融合液(0.3 mol/L 甘露醇+0.5 mmol/L Hepes+0.1 mmol/L CaCl2+0.1 mmol/L MgCl2) 的融合槽電極之間，調(diào)整細(xì)胞膜的接觸面與電極平行，施加直流電脈沖，融合參數(shù)根據(jù)試驗(yàn)調(diào)整脈沖場強(qiáng)125 V，脈沖次數(shù)2 次，脈沖時(shí)程20 μs。每批5～8 枚/次，操作完后卵子/供核細(xì)胞復(fù)合體放入培養(yǎng)液，30～60 min 后觀察融合情況，剔除沒有融合的復(fù)合體。放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，從重構(gòu)胚融合完計(jì)時(shí)2 h 后進(jìn)行激活，激活液與激活時(shí)間分別為7%乙醇7 min、2 μmol/L 6-DMAP 4 h，激活完畢后移入SOFaa清洗3 遍。38.5℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d 后檢查囊胚率并統(tǒng)計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPASS18.0 進(jìn)行卡方或方差檢驗(yàn)，P<0.01為差異極顯著；0.010.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體細(xì)胞的懸浮狀態(tài)對重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響

研究表明,在融合率方面，貼壁組2 h更換1次供核細(xì)胞的融合效率比懸浮組15～30 min更換1次供核細(xì)胞的融合效率要低，差異極顯著(78.84% vs 90.10%)(P<0.01)，但囊胚率差異不顯著(15.58%vs 14.65%)(P>0.05)。表1

表1 供核細(xì)胞的靜置狀態(tài)下重構(gòu)胚體外發(fā)育變化
Table 1 Effect of statical state on development of reconstructed embryos in vitro

2.2 復(fù)蘇的供體細(xì)胞傳代次數(shù)和匯合期抑制時(shí)間對克隆胚體外發(fā)育的影響

研究表明,在融合率方面，供體細(xì)胞生長匯合24和48 h時(shí)的差異不顯著(70.37%、76.03%、71.92%vs 72.97%)(P>0.05)。在囊胚率方面，解凍的供核細(xì)胞d2代比d1代高(9.06% vs 5.96%)，但差異不顯著(P>0.05)；d3代比d2代高(15.85% vs 9.06%)，差異顯著(P<0.05);d3組與d1組相比(15.85% vs 5.96%)差異極顯著(P<0.01)。而d3組，平臺(tái)期抑制48 h的供核細(xì)胞組囊胚率比抑制24 h的供核細(xì)胞組囊胚率高(20.16% vs 15.85%)，但差異不顯著(P>0.05)。表2

2.3 同一細(xì)胞不同克隆株對克隆胚胎發(fā)育的影響

研究表明,同一供體(東佛里生羊)早期原代細(xì)胞挑選2個(gè)96孔板即192個(gè)單克隆株培養(yǎng)后，其中7株具有較好的傳代性。在制作重構(gòu)胚時(shí)，供核細(xì)胞在融合方面存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)的差異性，但無規(guī)律可尋。在囊胚率方面，供核細(xì)胞對囊胚率的貢獻(xiàn)表現(xiàn)為顯著(P<0.05)或者極顯著性(P<0.01)，但無規(guī)律可尋。表3

表2 供核細(xì)胞的傳代和匯合期G0/G1抑制時(shí)間下重構(gòu)胚發(fā)育變化
Table 2 Effect ofpassages and G0/G1 phase period of confluency cell on development of reconstructed embryos in vitro

解凍傳代次數(shù)Passagesof thawed cell G0/G1抑制時(shí)程G0/G1 phase period of confluency cell(h)核移植數(shù)Couplets融合率Fusion rate(%)囊胚率Blastocyst rate(%)d12440570.37(285)5.96Aa(17)d22436376.03(276)9.06Aa(25)d32434271.92(246)15.85Bb(39)d34833372.97(243)20.16Bb(49)

表3 同一細(xì)胞不同克隆株下重構(gòu)胚體外發(fā)育變化
Table 3 The developmental of reconstructed embryos in vitro from Different line of mono adult fibroblast cell

同一細(xì)胞不同克隆株Different lines of mono donor核移植數(shù)Couplets融合率Fusion rate(%)囊胚率Blastocyst rate(%)424774.89Aa(185)18.92aA(35)1026482.19b(217)23.96aA(52)1141684.13Bb(350)34.57Bb(121)1922577.33Aa(174)22.99aC(40)2355678.95ab(439)32.12Bc(141)3824087.08Bb(209)25.84ac(54)11222786.34Bb(196)22.96aC(45)

2.4 不同供體羊細(xì)胞株對克隆胚胎發(fā)育的影響

研究表明,由不同供體羊建立的細(xì)胞株，在細(xì)胞直徑方面存在差異性，在融合率方面存在極顯著的差異性(P<0.01)。在囊胚率方面，肉羊重構(gòu)胚囊胚率極顯著(P<0.01)高于其他品種的囊胚率。表4

3 討 論

目前用于構(gòu)建克隆動(dòng)物和胚胎的供核細(xì)胞主要有乳腺上皮細(xì)胞[1]、顆粒細(xì)胞[10]、輸卵管上皮細(xì)胞、幼齡或成年動(dòng)物成纖維細(xì)胞[11-12]，以及小鼠腦組織細(xì)胞[5]。但在這些供核細(xì)胞建立時(shí)，每種細(xì)胞都有自己的培養(yǎng)特性和傳代特性，尤其是2種類型以上的細(xì)胞在同一組織中，在細(xì)胞建系時(shí)通常用到差速貼壁法建立并純化細(xì)胞[13]，在早期的研究中依據(jù)該原理發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞通過差速消化獲得的供核細(xì)胞對重構(gòu)胚的融合率有影響[8]，后來通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在貼壁效率上有差異的供核細(xì)胞其生長曲線也有差異性[9]，因此，試驗(yàn)進(jìn)一步規(guī)范操作過程，發(fā)現(xiàn)15～30 min內(nèi)懸浮的供核細(xì)胞用于重構(gòu)胚的融合效率極顯著高于長時(shí)間靜止在操作液中的供體細(xì)胞制作重構(gòu)胚的融合效率。推斷重構(gòu)胚的融合效率與供核細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)的細(xì)胞膜貼壁粘性有較大的關(guān)系，而長時(shí)間的靜置造成供核細(xì)胞膜粘性降低，而不利于couplets細(xì)胞膜的融合，但與克隆胚胎的囊胚率沒有顯著的相關(guān)性。

表4 不同供體羊細(xì)胞株下克隆胚胎發(fā)育變化
Table 4 The developmental of reconstructed embryos in vitro from Different line of multiple adult fibroblast cell

綿羊細(xì)胞品種Breeds of owe cell供核細(xì)胞直徑Cell diameter(μm)核移植數(shù)Couplets融合率Fusion rate(%)囊胚率Blastocyst rate(%)東佛里生羊East Friensian Milk sheep14.53±2.7476781.22B(623)12.52A(78)哈薩克羊Kazakh sheep18.13±2.722 71075.68A(2 051)13.90A(286)黑頭薩?？薆lack suffolk21.33±2.411 82983.82B(1 533)18.66B(286)澳洲白Australian white sheep20.34±1.971 64177.51A(1 272)24.06C(306)白頭薩?？薟hite suffolk22.23±2.861 91681.89B(1 569)26.45C(415)

供核細(xì)胞在生長階段G0、G1、S、G2/M期中、G1期停留的時(shí)間較長，為了使核移植供核細(xì)胞達(dá)到同期化，主要有血清饑餓法和生長匯合抑制法。多數(shù)研究人員支持血清饑餓處理法[14]以提高G0/G1期中G0期供核細(xì)胞比例，而生長抑制法并不能顯著提高G0的供核細(xì)胞比例[15]，卻是G1期細(xì)胞比例增加。隨著傳代次數(shù)的增加，這種處理不僅增加了染色體的異常率，而且會(huì)降低克隆胚胎和動(dòng)物的制作效率[16]，同時(shí)血清饑餓法隨著血清饑餓時(shí)間的增加，會(huì)逐漸引起供核細(xì)胞的凋亡和克隆囊胚凋亡小體比例增加[17-18]，因此，降低傳代次數(shù)，如何改善供核細(xì)胞以提高效率就成為一個(gè)重要的問題。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，解凍的早期供核細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加其重構(gòu)胚囊胚率越來越高，尤其是增加匯合期生長時(shí)間，囊胚率有漸進(jìn)性的提高，推測隨著匯合期生長時(shí)間的延長能夠提高G1期細(xì)胞的比例。Sangho Roh等[16]研究供核細(xì)胞隨著匯合時(shí)間的延長，G1期的細(xì)胞比例有所增加，而LiBing Ma等[19]用改進(jìn)的先匯合再饑餓法也有提高G0/G1期細(xì)胞比例從而改善克隆效率，這就表明匯合期增加供核細(xì)胞接觸抑制的時(shí)間能促進(jìn)重構(gòu)囊胚的發(fā)育。此外目前的觀點(diǎn)認(rèn)為傳代次數(shù)的增加不利于提高克隆效率，但Chikara Kubota等[20]將體細(xì)胞連續(xù)傳代后再進(jìn)行血清饑餓反而提高了克隆動(dòng)物的效率，換句話說這是否解釋為原代細(xì)胞或者解凍細(xì)胞通過短暫的幾次傳代能夠得到改善，但不是因?yàn)閭鞔啻稳旧w的異常而提高了克隆囊胚的效率[21]，上述試驗(yàn)證實(shí)這種假設(shè)是成立的。此外值得注意的是生長期階段的細(xì)胞通過控制時(shí)間差拍打法(shake-off，30～60 sec at medium speed)也能夠獲得較高G1期的細(xì)胞比例[16]，從而促進(jìn)克隆效率。

生長狀態(tài)良好的細(xì)胞不僅表現(xiàn)出良好的傳代貼壁特性，而且后期凋亡的細(xì)胞數(shù)量也小[9]。同時(shí)隨著短暫傳代次數(shù)的增加也逐漸表現(xiàn)出供體細(xì)胞對克隆囊胚的貢獻(xiàn)特性如試驗(yàn)2結(jié)果。對于單細(xì)胞克隆株，依據(jù)觀察記錄來看，傳代過程中尤其需要注意定時(shí)、及時(shí)更換液體以除去早期凋亡、生長能力差或者衰老的細(xì)胞。在制作轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物時(shí)，不論是那種轉(zhuǎn)基因方法，單一細(xì)胞的穩(wěn)定遺傳信息更有助于研究，那么同一細(xì)胞不同細(xì)胞株之間是否有差異，通過研究發(fā)現(xiàn)，同一成纖維細(xì)胞來源不同單細(xì)胞株之間不僅在融合方面表現(xiàn)出較大的差異性，而且在重構(gòu)胚囊胚率方面也表現(xiàn)出較大的差異性，這就進(jìn)一步表明同一供核細(xì)胞株在傳代過程中，更多因?yàn)槿藶榈囊蛩囟斐杉?xì)胞株之間的差異性，但也有研究表明轉(zhuǎn)基因與否并不影響克隆動(dòng)物的獲得[22]。此外試驗(yàn)結(jié)果也表明,融合特性較好的供體細(xì)胞組在囊胚率方面也稍微高于融合特性較差的細(xì)胞組，但不排除融合特性差的供體細(xì)胞能夠獲得較多數(shù)量的克隆囊胚。

在同一細(xì)胞來源不同單細(xì)胞株之間進(jìn)行了比較，而且在不同個(gè)體羊建立的細(xì)胞株之間也進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，不同品種的羊不僅在供核細(xì)胞直徑方面是有差異性的，而且在重構(gòu)胚制作效率方面也具有差異性。在制作重構(gòu)胚時(shí)，因供核細(xì)胞的選擇具有較大的隨意性，與操作人員有很大的關(guān)系，也直接影響著克隆胚的效率，研究表明,進(jìn)行小中大區(qū)分的供核細(xì)胞中，同批次細(xì)胞直徑越小的細(xì)胞G1期(生長匯合法)或者G0(血清饑餓法)比例越高[15]，這就解釋了重構(gòu)胚囊胚率差異較大的試驗(yàn)現(xiàn)象。此外，Nisar A也發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體之間的供體細(xì)胞在克隆效率和動(dòng)物妊娠方面存在較大的差異[23-34]?？寺∨咝什粌H受到細(xì)胞直徑(或人為判斷)的影響，而且受到供體細(xì)胞株本身的影響，研究中，肉羊細(xì)胞株的克隆效率高于其他品種綿羊細(xì)胞株的克隆效率，進(jìn)一步講這是否說明克隆效率是否與采樣時(shí)供體的營養(yǎng)水平或肉用品種有直接關(guān)系有待進(jìn)一步證實(shí)，但可以肯定的是克隆胚效率的高低具有較大的隨機(jī)性。

4 結(jié) 論

復(fù)蘇的供核細(xì)胞經(jīng)過短暫的3次傳代，延長匯合期細(xì)胞生長時(shí)間至48 h，在操作液中短時(shí)間(15～30 min)的靜置，為避免細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的人為因素，同批次供核細(xì)胞或不同個(gè)體多選擇幾株供核細(xì)胞更有利于克隆胚的制作，可以獲得較多數(shù)量的克隆胚。