張曉恒, 姚 佳, 秦冬梅

張曉恒, 江陰市中醫(yī)肝膽醫(yī)院 江蘇省江陰市 214431

姚佳, 秦冬梅, 石河子大學(xué)藥學(xué)院 新疆維吾爾自治區(qū)石河子市 832002

核心提要: 本研究探討了毛菊苣提取物對(duì)小鼠肝纖維化的保護(hù)作用, 結(jié)果表明毛菊苣95%和70%醇提取物對(duì)CCl4造成的化學(xué)性肝纖維化具有治療作用, 可為進(jìn)一步探究毛菊苣中有效成分及其作用機(jī)制奠定前期基礎(chǔ).

0 引言

毛菊苣為菊科菊苣屬植物, 系我國(guó)維吾爾習(xí)用藥材, 具有清肝利膽, 健胃消食, 利尿消腫功效; 用于濕熱黃疸,胃痛食少, 水腫尿少[1,2].肝纖維化是許多肝臟疾病的一個(gè)中間發(fā)展環(huán)節(jié), 延緩或阻止肝纖維化的形成, 對(duì)防治肝硬化具有重要意義[3].經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究, 毛菊苣根95%(CG-Ⅰ)與乙醇50%(CG-Ⅲ)乙醇提取物中主要有倍半萜內(nèi)酯類(lèi)、三萜、山萵苣苦素、萵苣苦素等[4,5], 70%(CG-Ⅱ)乙醇提取物中主要有黃酮、香豆素類(lèi)及生物堿等, 水提取物(CG-Ⅳ)中主要有有機(jī)酸及糖類(lèi)等[6].為了闡明毛菊苣的藥效物質(zhì)基礎(chǔ), 根據(jù)文獻(xiàn)[7,8]作者對(duì)毛菊苣的根進(jìn)行了藥材有效部位的提取、分離與動(dòng)物體內(nèi)活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)等一系列的研究.本實(shí)驗(yàn)的主要目的在于評(píng)價(jià)毛菊苣根95%、70%、50%的乙醇提取物及其水提取物對(duì)肝纖維化小鼠的影響, 比較獲得相對(duì)更加有效的提取物, 為毛菊苣生物活性成分研究以及新藥的研究與開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 清潔級(jí)KM小鼠,♂, 體重20 g± 2 g, 購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心新醫(yī)動(dòng)字SYXK(新)2012-0001.標(biāo)準(zhǔn)飼料, 自由飲水.

1.1.2 藥品與試劑: 四氯化碳(CCl4, 分析純), 甲醛(HCHO, 分析純), 植物油(市售大豆油, 中糧食品營(yíng)銷(xiāo)有限公司), 0.9%NaCl生理鹽水, 蒸餾水, CG-Ⅰ、CG-Ⅱ、CG-Ⅲ與CG-Ⅳ(實(shí)驗(yàn)室自制, 根據(jù)人體劑量換算給藥),水飛薊賓膠囊(天津天士力制藥股份有限公司, 生產(chǎn)批號(hào): 150511), 谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)(生產(chǎn)批號(hào): 20151224); 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)(生產(chǎn)批號(hào): 20151223); 肝組織堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)(生產(chǎn)批號(hào): 20151231);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)(生產(chǎn)批號(hào):20150113); 谷光甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)(生產(chǎn)批號(hào): 20151221); 考馬斯亮蘭蛋白試劑盒(生產(chǎn)批號(hào): 20151227), 試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所.

1.1.3 儀器與設(shè)備: TDL-50型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造), TS-8型旋渦混勻器(江蘇海門(mén)其林醫(yī)用儀器廠), FA210B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司),電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠), 多功能酶標(biāo)儀(Thermo 3001), Optima TM MAX-XP超速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司).

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理: 清潔級(jí)KM小鼠70只,♂, 隨機(jī)分為7組, 每組10只.分別為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物組(200 mg/kg)和藥物治療組(CG-Ⅰ 150 mg/kg、CG-Ⅱ 150 mg/kg、CG-Ⅲ 150 mg/kg和CG-Ⅳ 150 mg/kg).自造模之日起, 除空白對(duì)照組外, 其余各組背部皮下注射20% CCl4植物油溶液10 mL/kg, 2次/wk, 持續(xù)6 wk.從第7周開(kāi)始, 除空白對(duì)照組、模型組給予蒸餾水外, 其他各組動(dòng)物給予相應(yīng)劑量的提取物灌胃, 每日一次, 持續(xù)8 wk.末次給藥2 h后, 小鼠摘眼球取血, 并頸部脫臼處死,解剖取肝臟、脾臟組織.

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定: 小鼠摘眼球取血后處死, 取肝臟、脾臟, 稱(chēng)重, 計(jì)算肝臟、脾臟系數(shù).試劑盒檢測(cè)血清中ALT、AST的活性.肝組織反復(fù)勻漿3次制成10%的組織勻漿, 使用冷凍離心機(jī)4 ℃, 3500 r/min, 離心10 min, 取上清液, 測(cè)定肝組織中AKP、LDH、GSH-Px的活性.

1.2.3 肝組織HE染色石蠟包埋切片: 取小鼠的肝組織,用10%甲醛溶液固定, 石蠟包埋切片, 厚度約1 μm, HE染色后觀察組織病理變化.

1.2.4 肝組織Masson染色石蠟包埋切片: 小鼠肝組織石蠟包埋后切片厚度約1 μm, Masson染色后觀察組織病理變化.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以mean±SD表示, 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析, 比較采用單因素方差分析, 組間比較采用LSD法,P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 對(duì)肝臟、脾臟系數(shù)的影響 模型組小鼠與空白對(duì)照組相比, 肝臟系數(shù)明顯增加, 具有極顯著性差異(P＜0.01), 脾臟系數(shù)雖有增加的趨勢(shì), 但不具有顯著性差異(P＞0.05), 說(shuō)明造模比較成功.藥物治療組與模型組比較, 毛菊苣提取物均可降低肝臟系數(shù), 但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; CG-Ⅲ組可以顯著降低脾臟系數(shù)(P＜0.05)(表1).

2.2 對(duì)血清AST、ALT活性的影響 模型組小鼠與空白對(duì)照組相比, 血清中的AST、ALT活性顯著升高(P＜0.01).藥物治療組與模型組比較, 各組均可降低小鼠血清AST、ALT的活性, 且具有極顯著性差異(P＜0.01),結(jié)果見(jiàn)表2.

2.3 對(duì)肝組織AKP、LDH、GSH-Px含量的影響 模型組與空白對(duì)照組比較, 肝組織中GSH-Px含量降低, 具有極顯著性差異(P＜0.01), 而AKP與LDH的活性升高, 具極顯著性差異(P＞0.05).與模型組比較, 藥物治療組除了CG-Ⅲ組均可以升高小鼠肝組織GSH-Px含量(P＜0.01或P＜0.05), 具有顯著性差異.藥物治療組CG-Ⅰ和CG-Ⅱ?qū)π∈蟾谓M織AKP、LDH含量有降低的趨勢(shì), 具有極顯著性差異(P＜0.01), 結(jié)果見(jiàn)表3.

2.4 組織病理學(xué)檢查

2.4.1 HE染色: 空白對(duì)照組小鼠肝竇及匯管區(qū)無(wú)異常,肝小葉較完整, 肝索排列規(guī)則[9,10], 肝細(xì)胞及細(xì)胞核相對(duì)比較完整(圖1A).模型組小鼠肝小葉分割明顯, 肝竇不明顯, 肝細(xì)胞呈氣球樣變性, 有大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)[11,12],胞質(zhì)疏松(圖1B).陽(yáng)性藥對(duì)照組與模型組比較, 肝索排列較規(guī)則, 肝細(xì)胞的胞質(zhì)均勻, 炎細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少(圖1C).藥物治療組對(duì)CCl4所致小鼠酒精性肝纖維化的病理改變均具有恢復(fù)作用, CG-Ⅰ和CG-Ⅱ肝小葉分割顯著減輕, 肝竇明顯, 氣球樣變性顯著減少, 炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕(圖1).

2.4.2 Masson染色: 空白對(duì)照組小鼠的肝組織正常, 無(wú)膠原纖維增生, 組織結(jié)構(gòu)正常(圖2A).模型組肝組織與空白對(duì)照組比較, 膠原纖維增多, 形成膠原沉積, 破壞正常肝小葉結(jié)構(gòu), 纖維結(jié)締組織增生進(jìn)入肝小葉達(dá)中央靜脈周?chē)?圖2B), 說(shuō)明造模成功[13,14].陽(yáng)性藥對(duì)照組與模型組比較, 膠原纖維從匯管區(qū)周?chē)蛲廨p度延伸(圖2C).藥物治療組與模型組比較, 減少膠原纖維向外延伸, 無(wú)假肝小葉形成.表明毛菊苣提取物對(duì)小鼠肝纖維化具有保護(hù)作用(圖2D-G).

3 討論

肝纖維化是肝臟中纖維結(jié)締組織的長(zhǎng)期沉積進(jìn)而發(fā)展形成的.CCl4是實(shí)驗(yàn)研究中常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑, 其通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致細(xì)胞損傷, 長(zhǎng)時(shí)間刺激到一定程度后形成實(shí)驗(yàn)性肝纖維化, 該造模方法比較成熟, 常被用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化模型中.實(shí)驗(yàn)中所用陽(yáng)性藥為水飛薊賓膠囊, 其有效成分水飛薊賓為臨床使用保肝藥物.本實(shí)驗(yàn)中, 小鼠經(jīng)過(guò)造模后, 表現(xiàn)出了肝纖維化的癥狀, 而CG-Ⅲ組即50%乙醇提取物可以降低脾臟系數(shù), 對(duì)肝纖維化小鼠的肝、脾腫脹有一定抑制作用; 肝纖維化形成意味著細(xì)胞損傷, 肝細(xì)胞質(zhì)及線粒體中的ALT、AST釋放入血, 而藥物治療組均可使肝纖維化模型小鼠血清中的AST、ALT水平顯著降低, 從而實(shí)現(xiàn)保肝作用, 根據(jù)肝組織中AKP、LDH、GSH-Px含量的變化趨勢(shì), 可以初步判斷, CG-Ⅰ組和CG-Ⅱ組相較于模型組都有相當(dāng)大程度的改善, 可以看出其具有抗氧化活性, 并且可能通過(guò)這一途徑來(lái)起到抗肝纖維化的作用; 病檢結(jié)果可以看出藥物治療組小鼠的肝細(xì)胞變性、壞死和肝纖維化明顯減輕, 說(shuō)明毛菊苣提取物對(duì)小鼠肝纖維化有一定的防治作用.CG-Ⅰ組和CG-Ⅱ組對(duì)肝纖維化小鼠的肝小葉分割減輕尤其顯著.

表1 毛菊苣對(duì)肝纖維化小鼠肝臟、脾臟系數(shù)的影響(mean±SD, n = 10)

表2 毛菊苣對(duì)肝纖維化小鼠血清AST、ALT活性的影響(mean±SD, n = 10)

表3 毛菊苣對(duì)肝纖維化小鼠肝組織的AKP、LDH、GSH-Px含量的影響(mean±SD, n = 10)

圖1 各組小鼠肝纖維化病理變化(HE×200, 1:100 μm).A:空白對(duì)照組; B:模型組; C:陽(yáng)性藥物組; D:CG-Ⅰ組; E:CG-Ⅱ組; F:CG-Ⅲ組; G:CG-Ⅵ組.

圖2 各組小鼠肝纖維化病理變化(Masson×200, 1:100 μm).A:空白對(duì)照組; B:模型組; C:陽(yáng)性藥物組; D:CG-Ⅰ組; E:CG-Ⅱ組; F:CG-Ⅲ組;G:CG-Ⅵ組.

綜上所述, 通過(guò)對(duì)毛菊苣根的95%、70%、50%乙醇提取物與水提取物對(duì)小鼠肝纖維化的防治作用研究, 表明維藥毛菊苣確有保肝作用, 相比較而言,CG-Ⅰ組和CG-Ⅱ組即95%和70%乙醇提取物組的治療效果最佳, 該提取物主要含有倍半萜內(nèi)酯、三萜類(lèi)、黃酮和香豆素等化合物[15], 該研究分析比較了毛菊苣不同提取物在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面的效用, 從結(jié)果可以初步判定, 毛菊苣醇提物中的成分對(duì)于肝纖維化具有良好改善作用, 這對(duì)我們課題組后期對(duì)毛菊苣的活性成分及其對(duì)肝纖維化治療的作用機(jī)制奠定了物質(zhì)、理論基礎(chǔ).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

洗衣療法對(duì)于肝纖維化的治療具有很多的副作用, 所以現(xiàn)代治療傾向于中醫(yī)藥, 治療肝纖維化的方法主要分為兩種, 一種是針對(duì)于病因, 另外就是專(zhuān)注于肝纖維化形成本身的治療.毛菊苣作為新疆特色中藥, 研究其保肝機(jī)制有益于更好的解釋、推廣其保肝療效, 對(duì)于肝臟疾病的治療領(lǐng)域來(lái)說(shuō), 是更深一步的探索.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本文探究了毛菊苣不同溶劑及不同溶劑濃度提取物對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)劑引起的小鼠肝纖維化的治療作用, 通過(guò)比較得到療效最好的粗提物, 為后期進(jìn)一步研究其發(fā)揮作用的成分及發(fā)揮作用的機(jī)制提供理論基礎(chǔ).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本篇論文研究主要目標(biāo)是確定毛菊苣抗肝纖維化的作用以及有效成分所在部位, 初步確定其保肝機(jī)制.研究結(jié)果表明, 毛菊苣保肝活性主要體現(xiàn)在其95%、70%醇提物中, 而其保肝機(jī)制初步判定可能為抗脂質(zhì)過(guò)氧化.研究達(dá)到預(yù)期目標(biāo), 研究結(jié)果對(duì)課題組深入研究其保肝機(jī)制有重大意義.

實(shí)驗(yàn)方法

為實(shí)現(xiàn)本文預(yù)期目標(biāo), 過(guò)程中進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn), 通過(guò)試劑盒、H&E染色、MASSON染色進(jìn)行生化及組織病理學(xué)分析, 用SPASS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.其中CCl4背部皮下注射是經(jīng)典的造肝纖維化模型的方法, 該方法能相當(dāng)程度上體現(xiàn)臨床患者肝纖維化的各項(xiàng)臨床表現(xiàn), 符合試驗(yàn)?zāi)康? 貼合實(shí)驗(yàn)要求.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

毛菊苣醇提物及水提物對(duì)CCl4引起的肝纖維化具有一定的逆轉(zhuǎn)作用, 能夠抑制肝臟腫脹度, 降低肝細(xì)胞損傷引起的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肝組織堿性磷酸酶及乳酸脫氫酶的升高, 降低谷光甘肽過(guò)氧化物酶的水平, 從病理切片可以看出毛菊苣能夠減輕肝臟氣球樣變性, 減少炎癥浸潤(rùn), 治療組相較于模型組, 肝小葉也更完整, 趨近于正常肝組織切片狀態(tài).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本文是首次對(duì)比毛菊苣不同溶劑提取物抗小鼠肝纖維化的活性, 對(duì)抗肝纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)效果對(duì)比, 從給藥成分的不同這個(gè)角度縮小了毛菊苣抗肝纖維化的有效成分的范圍, 對(duì)毛菊苣在肝纖維化治療方面的成分不明確這一傳統(tǒng)中藥成見(jiàn)的打破是有效的鋪墊.文章結(jié)論對(duì)未來(lái)臨床用藥具有借鑒意義.

展望前景

隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥的發(fā)展, 中藥治療各種疾病的優(yōu)勢(shì)漸漸突出, 但始終存在有效成分不明確的現(xiàn)象, 而限制中藥的推廣使用, 本實(shí)驗(yàn)研究希望通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確有效成分所在部位, 確定有效成分及其作用機(jī)制將是本課題組下一步重點(diǎn)研究方向.