萬 琦，余寶剛

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院急診內(nèi)科，河北 唐山 063000)

心室重構(gòu)的病理基礎(chǔ)為：在心肌梗死區(qū)，壞死心肌細(xì)胞由瘢痕組織取代[1]；在非心肌梗死區(qū)，心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重建，導(dǎo)致心臟功能和結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)一步發(fā)展為心力衰竭，嚴(yán)重影響患者的生命健康。因此探討心肌梗死后心室重構(gòu)的機(jī)制對(duì)其診治具有重要意義[2]。研究[3-4]顯示：微小RNA-125b(micro RNA-125b，miR-125b)在心肌纖維化中發(fā)揮重要作用，抑制miR-125b可抑制心肌梗死后心室重構(gòu)，但其具體機(jī)制尚不十分清楚。研究[5-6]表明：miR-125b可通過磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylionsitol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinases，Akt)等多種信號(hào)通路參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活對(duì)心肌組織有保護(hù)作用。本研究擬探討miR-125b通過PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)大鼠心肌梗死后心室重構(gòu)的影響,闡明其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 健康、清潔級(jí)SD大鼠75只，12周齡，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0008。miR-125b 抑制物(中國廣州銳博生物科技有限公司)，蘇木素、Masson試劑盒和免疫熒光試劑盒(美國Sigma公司)，兔抗鼠心鈉肽(ANP)單克隆抗體、兔抗鼠腦鈉肽(BNP)單克隆抗體、兔抗鼠PI3K單克隆抗體、兔抗鼠Akt單克隆抗體和兔抗鼠磷酸化Akt (p-Akt)單克隆抗體(美國Abcam公司)。凝膠成像儀和電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、建模及處理 75只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、心肌梗死組和miR-125b抑制物組，每組25只。心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠建立急性心肌梗死模型：將大鼠禁食12 h后水合氯醛腹腔注射麻醉，氣管插管、連接動(dòng)物呼吸機(jī)，監(jiān)測心電圖；將大鼠備皮消毒后從左外側(cè)經(jīng)第3肋間隙切口進(jìn)入胸腔，暴露大鼠心臟，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，心電圖ST-T弓背向上抬、左室前壁顏色變白表示心肌梗死動(dòng)物模型建立成功。假手術(shù)組大鼠前降支只穿線，不結(jié)扎。術(shù)后24 h，miR-125b抑制物組大鼠經(jīng)尾靜脈注射miR-125b抑制物(80 mg·kg-1)，假手術(shù)組和心肌梗死組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水，每周1次，共4周。4周后假手術(shù)組大鼠死亡3只，模型組大鼠死亡5只，miR-125b抑制物組大鼠死亡4只。最終每組取20只大鼠進(jìn)行各指標(biāo)測量：每組取10只大鼠的心臟組織進(jìn)行HE染色、Masson染色和免疫熒光染色；每組取剩余10只大鼠心臟組織用于左心室肥厚指數(shù)測定和Western blotting法測定。

1.3 左心室肥厚指數(shù)測定 4周后電子天平稱大鼠體質(zhì)量，處死大鼠取心臟，剪去大血管和左右心耳，沖洗干凈，電子天平秤稱質(zhì)量。剪去右心室和左右心房，將左心室及室間隔稱質(zhì)量，計(jì)算左心室肥厚指數(shù)，包括心臟質(zhì)量/體質(zhì)量(HW/BW)、(左心室+室間隔)質(zhì)量/體質(zhì)量[(LV+S)/BW]和(左心室+室間隔)質(zhì)量/心臟質(zhì)量[(LV+S)/HW]。

1.4 HE染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)表現(xiàn) 處死大鼠，取心臟組織置于甲醛中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋，切成厚度為4 μm切片，常規(guī)進(jìn)行HE染色，觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)表現(xiàn)。

1.5 Masson染色觀察心肌組織纖維化情況 將各組大鼠心肌組織烤片60 min，經(jīng)脫蠟至水，蘇木素染色10 min，鹽酸酒精分化10 s，麗春紅酸性品紅染色5 min，苯胺藍(lán)復(fù)染15 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍片觀察染色情況。藍(lán)色為膠原纖維，紅色為心肌細(xì)胞。采用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算大鼠心肌膠原容積積分，膠原容積積分=膠原面積/總面積×100%。

1.6 免疫熒光染色法觀察大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平 將各組大鼠心肌組織切片加入丙酮固定，PBS液沖洗，山羊血清封閉，加入一抗(兔抗鼠Ⅰ型膠原蛋白單克隆抗體和兔抗鼠Ⅲ型膠原蛋白單克隆抗體)(1∶1 000)過夜孵育，PBS沖洗，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗(1∶200)孵育1 h，PBS沖洗，甘油封片，200倍光鏡下觀察免疫熒光染色情況。采用Image Pro Plus 6.0分析軟件測定目標(biāo)蛋白熒光強(qiáng)度即積分光密度(IOD)值，代表目的蛋白表達(dá)水平。

1.7 Western blotting法測定大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中ANP、BNP、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平 取3組大鼠左心室梗死和非梗死交界處心肌組織，采用全蛋白提取法提取心肌梗死周邊區(qū)總蛋白，BCA法測定3組蛋白濃度，每組取50 μg上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后加入一抗：兔抗鼠ANP單克隆抗體(1∶600)、兔抗鼠BNP單克隆抗體(1∶600)、兔抗鼠PI3K單克隆抗體(1∶800)、兔抗鼠Akt單克隆抗體(1∶700)和兔抗鼠p-Akt單克隆抗體(1∶600)過夜孵育，加入熒光二抗(1∶4 000)孵育1 h，以β-actin為內(nèi)參照，采用Fusion生物凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描各條帶吸光度(A)值。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶A值/β-actin條帶A值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠左心室肥厚指數(shù) 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠HW/BW、(LV+S)/BW和(LV+S)/HW均明顯升高(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠HW/BW、(LV+S)/BW和(LV+S)/HW明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠左心室肥厚指數(shù)Tab.1 Left ventricular hypertrophy indexes of rats in various groups

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with myocardial infarction group.

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)表現(xiàn) 假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核明顯；心肌梗死組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，腫脹、增粗明顯，細(xì)胞間隙可見大量網(wǎng)狀分布膠原纖維增生，并有明顯炎性細(xì)胞浸潤；miR-125b抑制物組大鼠心肌細(xì)胞排列較為整齊。見圖1(插頁六)。

A:Sham operation group;B:Myocardial infarction group;C:MiR-125b inhibitor group.
圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)表現(xiàn)(HE，×200)
Fig.1 Morphology of myocardium tissue of rats in various groups (HE，×200)

2.3 各組大鼠心肌組織纖維化情況 假手術(shù)組大鼠心肌組織呈均勻紅色，無融合及條索狀膠原纖維；心肌梗死組大鼠梗死區(qū)心肌組織可見大量膠原纖維，呈條索狀分割心肌束；miR-125b抑制物組大鼠心肌組織膠原纖維明顯減少。與假手術(shù)組(5.31%±1.24%)比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠心肌組織膠原容積積分(47.63%±1.18%和13.51%±0.98%)明顯升高(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠心肌組織膠原容積積分明顯降低(P<0.05)。見圖2(插頁六)。

A:Sham operation group;B:Myocardial infarction group;C:MiR-125b inhibitor group.
圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果(×200)
Fig.2 Masson staining results of myocardium tissue of rats in various groups (×200)

2.4 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表2和圖3(插頁六)。

A-C: Type Ⅰ collagen;D-F: Type Ⅲ collagen;A,D:Sham operation group;B,E:Myocardial infarction group;C,F:MiR-125b inhibitor group.
圖3 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原免疫熒光染色結(jié)果(×200)
Fig.3 Immunofluorescence staining results of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen in myocardium tissue of rats in various groups (×200)

表2 各組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen proteins in myocardium tissue of rats in various groups

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with myocardial infarction group.

2.5 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中ANP和BNP蛋白表達(dá)水平 與假手術(shù)組比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中ANP和BNP蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中ANP和BNP蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表3和圖4。

2.6 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中Akt蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，心肌梗死組和miR-125b抑制物組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與心肌梗死組比較，miR-125b抑制物組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表4和圖5。

表3 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中ANP和BNP蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of ANP and BNP proteins in peripheral region tissue of myocardial infarction of rats in various groups

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with myocardial infarction group.

Lane 1:Sham operation group; Lane 2:Myocardial infarction group; Lane 3:MiR-125b inhibitor group.
圖4 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中ANP和BNP蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.4 Electrophoregram of expressions of ANP and BNP proteins in peripheral region tissue of myocardial infarction of rats in various groups

3 討 論

心肌梗死可引起心肌成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)代償性活化，分泌大量膠原蛋白，損傷心肌組織功能，造成心肌纖維化和心室重構(gòu)等病理過程，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[7-8]。心臟非梗死區(qū)心肌纖維化是心室重構(gòu)進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]，因此研究心肌細(xì)胞纖維化的調(diào)控機(jī)制對(duì)于防治心力衰竭具有重要作用。

miRNA為內(nèi)源性RNA，相對(duì)分子質(zhì)量小，可結(jié)合靶mRNA的編碼區(qū)、3′端非編碼區(qū)和5′端非編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，降解或抑制靶mRNA翻譯，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種病理生理進(jìn)程[10]。近年來研究[11-12]顯示：miRNA在心血管疾病及心臟病理生理過程中發(fā)揮重要作用，在心力衰竭和心肌肥厚等心血管疾病中均存在miRNA表達(dá)異常，在心室重構(gòu)中也存在miRNA異常表達(dá)。miR-125b 在心肌纖維化中具有重要作用，miR-125b模擬物轉(zhuǎn)染可上調(diào)成人心臟成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白水平，促進(jìn)成人心臟成纖維細(xì)胞增殖、遷移和凋亡，通過轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)/Smad通路參與心肌纖維化進(jìn)程[13]。miR-125b可介導(dǎo)預(yù)防心肌梗塞中的細(xì)胞死亡促進(jìn)心臟修復(fù)[14]。本研究結(jié)果顯示：心肌梗死大鼠左心室肥厚指數(shù)和膠原容積積分升高，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、ANP和BNP蛋白水平表達(dá)水平明顯升高。ANP和BNP為重要的心臟內(nèi)分泌激素，梗死交界區(qū)ANP和BNP水平可反映心肌梗死局部張力，是心肌細(xì)胞病理性肥大的比較可靠的指標(biāo)，在判定心室重構(gòu)中具有重要價(jià)值[15-16]。本研究結(jié)果表明：心肌梗死模型大鼠心肌肥厚，存在心肌纖維化和心室重構(gòu)，給予miR-125b抑制物處理后，心肌梗死模型大鼠左心室肥厚指數(shù)和膠原容積積分降低，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、ANP和BNP蛋白水平降低，表明抑制miR-125b可抑制心肌梗死模型大鼠心肌肥厚，改善心肌纖維化和心室重構(gòu)。

表4 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expession levels of PI3K, Akt and p-Akt proteins in peripheral region tissue of myocardial infarction of rats in various groups

*P<0.05 compared with sham operation group;△P<0.05 compared with myocardial infarction group.

Lane 1:Sham operation group; Lane 2:Myocardial infarction group; Lane 3:MiR-125b inhibitor group.
圖5 各組大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.5 Electrophoregram of expessions of PI3K,Akt and p-Akt proteins in peripheral region tissue of myocardial infarction of rats in various groups

miR-125b參與心肌纖維化和心室重構(gòu)過程，但其作用機(jī)制尚不清楚。miR-125b可通過多種信號(hào)通路參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程，過表達(dá)miR-125b可通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[17]。PI3K/Akt信號(hào)通路參與心肌纖維化進(jìn)程，如調(diào)節(jié)第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源性基因(PTEN)-PI3K / AKT信號(hào)通路可調(diào)節(jié)心肌梗死后的心肌纖維化[18]；PI3K/Akt通路介導(dǎo)TRPV1抑制離體大鼠心臟缺血再灌注后的細(xì)胞凋亡[19]；PI3K/AKT信號(hào)通路在甲狀腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡中具有重要作用[20]。本研究結(jié)果顯示：心肌梗死后心室重構(gòu)大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯降低，給予miR-125b抑制物處理后心肌梗死大鼠心肌梗死周邊區(qū)組織中PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平升高，表明心肌梗死后心室重構(gòu)大鼠心肌梗死周邊存在PI3K/Akt信號(hào)通路抑制，抑制miR-125b可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抑制心肌纖維化和心室重構(gòu)的作用。

綜上所述，抑制miR-125b的表達(dá)可抑制心肌梗死后心室重構(gòu)進(jìn)程，其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。