邱 靜，鄢文靜，張雨婷，譚子虎，楊 瓊

(湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，湖北 武漢 430061)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是與年齡相關的癡呆癥中最常見的類型，可導致嚴重的不可逆的認知衰退和大量神經變性[1]。AD發(fā)病機制復雜，目前還缺乏明確有效的防治藥物。中醫(yī)藥在辨證論治、整體觀念指導下，針對AD等復雜疾病具有一定的優(yōu)勢。中醫(yī)認為AD的病機特點為脾腎虧虛、痰瘀互結。本課題組根據AD病機特點組方加減薯蕷丸，在前期的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)加減薯蕷丸可以提高輕、中度AD患者簡易智能狀態(tài)量表評分，改善日常生活能力，同時可以降低中醫(yī)證候積分[2]。但加減薯蕷丸在改善AD癥狀中的作用機制尚未明了，因此本研究應用APP/PS1雙轉基因小鼠模型，研究加減薯蕷丸具體作用效應及其可能機制，為藥物臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級5月齡健康雄性APP/PS1雙轉基因小鼠(B6C3-TgAPPswe/PS1de9)20只，購于南京大學模式動物研究所，動物生產許可證號：SCXK(蘇)2018-0008，體質量(33.7±3.2)g。飼養(yǎng)于湖北省中醫(yī)院SPF級實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2017-0095]。溫度(21±3)℃，相對濕度(60±5)%，自由攝食攝水，12 h明暗交替。

1.2 實驗藥物 加減薯蕷丸濃縮劑(又名薯蕷健脾益智合劑，由湖北省中醫(yī)院制劑中心制備，批準文號：鄂藥制字Z20150027，批號 20190101)，組方：山藥30 g，制何首烏、熟地黃各24 g，黨參、白芍、當歸各20 g、麩炒白術、茯苓、枸杞子各18 g，石菖蒲14 g，杜仲、遠志各12 g，川芎、五味子各10 g。上14味中藥，加水煎煮3次，每次1 h，過濾后合并濾液，經物理方法濃縮提純而成口服液250 mL，生藥含量1 g/mL，真空包裝，4 ℃冷藏備用。

1.3 主要試劑 RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天，ECL底物液購于Thermo；二抗購于武漢博士德，微管相關蛋白3(microtubule-associated light chain3，LC3)B(14/16 kD)、組織蛋白酶B(cathepsin B，CTSB)、溶酶體膜相關蛋白1(lysosomal-associated membrane proteins 1，LAMP1)、P62購于CST；β淀粉樣蛋白42(amyloid-β42，Aβ42)試劑盒購于elabscience；Nonidet P40試劑盒、轉錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)抗體購于美國Santa。

1.4 主要儀器 Morris水迷宮：成都泰盟科技有限公司；mulISKANMK3型酶標儀：美國Thermo公司；HI650型離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；微量移液器：Eppendorf；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；垂直電泳槽：北京六一儀器廠。

2 方法

2.1 分組及干預方法 20只APP/PS1小鼠，隨機分為模型組、中藥組，每組10只；另取10只同窩陰性小鼠作為對照組，中藥組給予加減薯蕷丸按每日14 g/kg(根據有效大鼠劑量[3-4]換算)灌胃，每日1次，連續(xù)28 d；模型組和對照組予以等容積生理鹽水灌胃。

2.2 觀測指標及方法

2.2.1 Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力 灌胃28 d后，采用Morris水迷宮檢測小鼠空間學習記憶能力，正式測驗前4 d開始獲取訓練：置于圓形水池，水下平臺位于第3象限，小鼠從第4象限入水，實時攝像監(jiān)測到達水下平臺的時間(逃避潛伏期，90 s內)，超過90 s未找到則予以長桿引導至平臺，停留15 s后移出。如此連續(xù)訓練4 d，第5天撤去水下平臺，進行探索試驗。實時攝像記錄時間段內探索軌跡，通過分析軟件計算平臺跨越次數(shù)、目標象限時間百分比。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測海馬組織中Aβ42水平 將海馬組織在PBS中勻漿，然后用RIPA緩沖液進行勻漿。根據說明書，通過特異性酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測Aβ42的濃度。

2.2.3 Western blot檢測海馬組織中CTSB、P62、LAMP1、LC3、TFEB蛋白水平 根據最小動物樣本量及獲得統(tǒng)計學意義的實驗結果所需達到最低生物學重復，通過SPSS 19.0軟件計算，取其中6只進行蛋白水平檢測。小鼠腹腔麻醉后直接斷頭取腦，冰上迅速分離雙側海馬用于組織總蛋白提取，將新鮮海馬組織剪碎，冰上研磨，加入組織裂解液后靜置30 min、4 ℃離心后取上清，加入上樣緩沖液裂解變性備用；同時根據文獻[5]提取核內蛋白：將新鮮海馬組織剪碎，冰上研磨，冰浴、離心后取下層沉淀物，對沉淀物重新進行重懸，加入100～200 μL含Nonidet P40緩沖液，冰浴10 min，4 ℃離心，吸盡上清液后的沉淀部分是細胞核，再次加入50～100 μL普通緩沖液，4 ℃離心，所獲上清液即為細胞核蛋白。

每孔蛋白上樣量30 μg，電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；按不同濃度(CTSB、P62濃度為1∶1 000，LAMP1、LC3濃度為1∶2 000，TFEB濃度為1∶250)稀釋一抗抗體，4 ℃過夜；1倍TBST液洗3次，每次5 min；二抗(1∶10 000)室溫搖床1 h；1倍TBST液洗3次，每次10 min；ECL發(fā)光液使條帶可視化。Image J 1.41軟件測量條帶灰度值。

3 結果

3.1 各組小鼠學習記憶能力比較 水迷宮定位航行第1～4天，每組小鼠逃避潛伏期逐漸縮短。在第4天的實驗中，與對照組相比，模型組小鼠逃避潛伏期延長(P<0.05)；與模型組相比，中藥組小鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)。空間探索實驗顯示，與對照組相比，模型組小鼠穿越平臺次數(shù)及在原平臺象限停留時間占比均顯著減少(P<0.05)；與模型組相比，中藥組小鼠穿越平臺次數(shù)及在原平臺象限停留時間占比明顯增多(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠游泳軌跡圖

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組小鼠海馬組織Aβ42含量比較 模型組小鼠海馬組織中Aβ42含量顯著高于對照組[(0.428±0.018)vs(0.208±0.013),P<0.05]；中藥組小鼠海馬組織中Aβ42含量為(0.277±0.014)，顯著低于模型組(P<0.05)。

3.3 各組小鼠海馬組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62、LAMP1、CTSB蛋白表達水平比較 與對照組相比，模型組小鼠海馬組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高，P62蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)，LAMP1、CTSB蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)；與模型組比較，中藥組小鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值無明顯變化(P>0.05)，LAMP1、CTSB蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)，P62蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 Western blot檢測各組小鼠海馬組織CTSB、P62、LAMP1、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 各組小鼠海馬組織細胞核內TFEB表達水平比較 與對照組相比，模型組小鼠海馬組織細胞核內TFEB和總TFEB表達水平均顯著上調(P<0.05)；與模型組相比，中藥組海馬組織細胞核內TFEB表達水平顯著上調(P<0.05)，總TFEB表達水平無明顯變化(P>0.05)。見圖5、圖6。

圖5 Western blot檢測各組小鼠海馬組織細胞核內TFEB及總TFEB表達水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

加減薯蕷丸源于漢代張仲景《金匱要略》中的薯蕷丸，由已故名老中醫(yī)呂繼端教授去其祛風之藥，取其補中之效，同時加用補腎填精、化痰開竅藥物以切合癡呆脾腎虧虛、痰瘀互結的病機化裁形成。在對小鼠行為學觀察實驗中，給予加減薯蕷丸干預4周后，小鼠的逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)均有不同程度改善，提示加減薯蕷丸可以改善APP/PS1模型的小鼠學習記憶能力。

Aβ的生成和清除失衡被認為是AD的核心病理改變，Aβ在腦內的聚集可以引發(fā)神經細胞缺失和認知功能損害[1]。自噬作為真核細胞重要的分解代謝過程，越來越多的研究顯示自噬在Aβ的產生和降解過程中起著重要作用，自噬功能異常可能是AD的發(fā)病機制之一[6]。自噬體形成后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，以有效清除螯合的內容物，這一過程即自噬-溶酶體途徑(autophagy lysosome pathway，ALP)。在AD中，ALP途徑呈進行性下降[7]，蛋白質降解受損，同時神經突起存在自噬體和溶酶體內細胞器的累積[8]。在受損神經軸突中，β-分泌酶水平升高，斑塊形成增多[9]。自噬溶酶體功能障礙同時會引起內吞淀粉樣前體蛋白囊泡的轉運時間延長，增加被β-分泌酶和γ-分泌酶切割傾向，導致Aβ生成增加[10-11]。在本實驗中，模型組海馬Aβ42水平較對照組增加，同時LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，提示腦內錯誤折疊蛋白Aβ引起保護性自噬水平增加，但LC3Ⅱ水平升高同時可能是溶酶體功能障礙，下游清除功能受損的結果[12]；經加減薯蕷丸干預后，海馬區(qū)Aβ42水平下降，中藥組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有增加，但與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明加減薯蕷丸可能通過促進下游溶酶體降解，增加Aβ清除并減少LC3Ⅱ堆積。P62作為自噬底物轉運蛋白，將泛素化蛋白質轉運至自噬體并被溶酶體降解，當自噬功能缺陷時，P62在細胞質中不斷累積[13]，與對照組相比，模型組P62水平明顯增加，表明6月齡(5月齡老鼠經干預治療后月齡為6)APP/PS1小鼠開始出現(xiàn)溶酶體功能障礙，經加減薯蕷丸干預后，中藥組P62蛋白累積得以部分緩解。CTSB是溶酶體主要的天冬酰胺蛋白酶，反映溶酶體降解功能，LAMP1可以直接反映自噬體和溶酶體的成熟度，經加減薯蕷丸干預后，中藥組LAMP1、CTSB水平增加，結合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62蛋白水平也進一步證明小鼠海馬區(qū)自噬溶酶體功能得以改善。

目前已有文獻表明，TFEB是ALP的主要調節(jié)因子，可以增加自噬和溶酶體基因的表達，刺激自噬體-溶酶體融合和自噬體內容物的降解[14]。TFEB動態(tài)調節(jié)ALP，增加TFEB表達是一種較高效率誘導自噬清除的途徑[15]。TFEB活性是通過磷酸化調節(jié)，TFEB磷酸化使其與伴侶蛋白14-3-3的結合并保持在細胞質中無法發(fā)揮作用，而去磷酸化的TFEB/14-3-3復合物解離使TFEB轉運至細胞核發(fā)揮轉錄激活靶基因的作用[16]。在AD模型中，增加TFEB的核內聚集可以加速淀粉樣蛋白前體蛋白在溶酶體中的降解，從而減少Aβ的產生和淀粉樣蛋白斑塊的沉積[11，17]。本實驗中，與模型組相比，中藥組核內TFEB明顯增加，表明加減薯蕷丸增加TFEB核內移位，增加自噬溶酶體途徑清除錯誤折疊蛋白能力，減少海馬區(qū)Aβ水平。

加減薯蕷丸方中山藥、熟地黃、制何首烏、杜仲、枸杞子、五味子滋補肝腎、填精益髓；黨參、白術、茯苓健脾益氣；石菖蒲、遠志化痰開竅益智；白芍、當歸、川芎活血祛瘀。全方共奏健脾補腎、化痰祛瘀、開竅益智之效。自噬與中醫(yī)痰瘀概念相似，衰老細胞器、錯誤折疊蛋白屬于中醫(yī)內生痰瘀之邪，痰瘀產生與自噬溶酶體功能障礙密切相關，有研究表明，多種活血化瘀藥物可以起到調節(jié)自噬的作用[18]。組方中遠志、石菖蒲、芍藥等藥物有效成分可從不同角度增強自噬途徑，減少Aβ沉積[19]。綜上所述，加減薯蕷丸通過促進TFEB核轉移增強自噬溶酶體途徑，減少海馬區(qū)Aβ42水平，改善APP/PS1模型小鼠學習記憶能力。但AD發(fā)病機制復雜，而加減薯蕷丸可能還存在更多的作用靶點和影響機制，值得進一步深入研究。