李可月 ，李 都，王 鎂

(1.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院內分泌科，遼寧 沈陽 110032)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一[1]，作為缺血性心腦血管疾病的病理基礎，AS的防治對糖尿病患者臨床二級預防有著重要的意義。其發(fā)病機制之一血管內皮氧化應激學說被學者廣泛認同[2]。核轉錄因子E2相關因子2(neclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)調控氧化應激的重要信號通路，通路中Nrf2及血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等均具有明顯的抗氧化應激作用[3]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的過度表達，使血管內皮細胞病理增生，對血管內皮產生的損傷，可使AS進一步發(fā)展[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)木丹顆粒對糖尿病患者AS有干預作用[5]。本研究在此基礎上觀察木丹顆粒對高糖環(huán)境下人血管內皮細胞Nrf2/ARE信號通路及血管內皮生長因子VEGF表達的影響，并進一步探討木丹顆粒對糖尿病AS的影響是否與Nrf2/ARE信號通路抗氧化應激、減少VEGF含量有關。

1 材料

1.1 動物 SPF級6周齡雄性Wistar大鼠30只，體質量(230±20)g，生產許可證號：SCXK(遼)2015-0001，于遼寧長生生物技術有限公司采購。此實驗已通過遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準(編號：20161202)，操作步驟均符合中國倫理委員會動物研究相關指導原則。

1.2 細胞 人血管內皮細胞株(貨號 4200)：廣州吉妮歐生物科技有限公司，美國Sciencell研究實驗室。

1.3 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液(批號 10040586R、AB10115027)：Hyclone公司；Trizol試劑(批號 14105)：Invitrogen公司；胎牛血清(批號 1108862)：Gibco公司；兔源β-actin一抗(批號 4970)：Cell Signaling公司；Prime Script?RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、ROX Plus試劑盒(批號 RR047A，RR82LR)：Takara公司；人VEGF酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批號 AE98006Hu)：AMEKO公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒(批號 P0019、P0018A、P0012AC、P0012S)：碧云天生物技術有限公司；顯影定影試劑盒；特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒。

1.4 儀器 MCO-15AC型細胞培養(yǎng)箱：Sanyo公司；SW-CJ-1CU超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；MR1822型低溫高速離心機：Jouan SA公司；INFINITE M200型多功能酶標儀：TECAN公司；DU640型蛋白核酸分析儀：Beckman公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-40C型轉移電泳儀：北京六一儀器廠；Stratagene Mx3000P型熒光定量PCR儀：Agilent公司；Chemi Imager 5500型凝膠成像分析系統(tǒng)：Alphainnotech Chemi Imager公司。

1.5 藥物 木丹顆粒(準字號z20080033)：營口奧達制藥有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 解凍人血管內皮細胞株，完全溶解復蘇后將其配制成細胞懸液，在96孔板及培養(yǎng)瓶中分種，將溫度設置成37 ℃恒溫，在濃度為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后吸除、棄去細胞培養(yǎng)液及未貼壁細胞，更換培養(yǎng)液，在細胞呈單層貼壁生長后延長至每2～3 d換液，多次換液培養(yǎng)至細胞生長融合達80%。

2.2 細胞傳代 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，吸除瓶內培養(yǎng)液并重復用PBS洗去殘留培養(yǎng)液2次，加入1 mL室溫胰蛋白酶，晃動培養(yǎng)瓶1～3 min后放至顯微鏡下，觀察細胞生長情況，當細胞間隙變大，胞質回縮變圓時，立即拿入超凈工作臺加適量胎牛血清培養(yǎng)液以結束消化。采用無菌吸管輕輕吹打貼壁細胞表面，制細胞懸液，轉速1 800 r/min離心機進行離心，10 min后結束，棄去上清，加入適量培養(yǎng)液，等量分種，置于恒溫培養(yǎng)箱中，靜止期時將其隨機分為3組。

2.3 制備含藥血清 將30只SPF級6周齡雄性Wistar大鼠，隨機分3組(正常組、模型組、木丹顆粒組)，每組10只，適應性飼養(yǎng)1周，木丹顆粒組用每日2.3 g/kg的給藥劑量灌胃[6]，正常組和模型組大鼠用等容積生理鹽水灌胃，期間各組大鼠自由喂食，連續(xù)5 d。在第5天灌胃結束1 h后，各大鼠通過腹主動脈收集血液。將各組血液以3 000 r/min離心后，取血清，在56 ℃水浴中滅活補體40 min，除菌分裝后，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 含藥血清培養(yǎng)細胞 細胞培養(yǎng)復制模型以藥物作用最佳時間和最佳高糖濃度[7]，正常組以5 mmol/L葡萄糖+15%正常鼠血清培養(yǎng)，模型組以30 mmol/L葡萄糖+15%正常鼠血清培養(yǎng)，木丹顆粒組以30 mmol/L葡萄糖+15%木丹顆粒血清培養(yǎng)，1 d后收集細胞及上清液檢測指標。

2.5 觀察指標及方法

2.5.1 RT-PCR檢測Nrf2及HO-1的mRNA表達水平 取出人血管內皮細胞，加入1 ml Trizol，根據(jù)說明提取總RNA，用核酸蛋白分析儀測3組各6份樣品的吸光度A，完成RNA的濃度測定，用電泳觀察RNA完整性。根據(jù)反轉錄試劑盒說明制備cDNA，備存于4 ℃溫度下。接下來以2×SYBR Green QPCR Master Mix 10 μL，RNase Free H2O 3.7 μL的反應體系進行PCR擴增。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。對照熒光染料0.3 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，反轉錄產物cDNA 2 μL，Primer-BLAST[8]設計引物，引物序列見表1。獲取的Ct值根據(jù)Pfaffl MW[9]法計算待測目的基因的相對表達量。

2.5.2 Western blot檢測Nrf2及HO-1的蛋白表達水平 配置制備BCA工作液(稀釋對照品A∶B為50∶1)，取3組各6個樣品及各濃度標準品100 μL加入EP管中，根據(jù)說明書提取、測定蛋白濃度。將蛋白與適量上樣緩沖液的混合液加熱變性后進行SDS-PAGE電泳分離，轉膜后封閉1 h(5%脫脂奶粉)，加一抗(1∶3 000，4 ℃，過夜)，TBST洗膜3次后加二抗(1∶5 000，室溫，1 h)。孵育完成洗膜3次。以β-actin為內參照，根據(jù)ECL發(fā)光法記錄曝光圖片，分析條帶灰度值。

2.5.3 ELISA檢測VEGF含量 根據(jù)ELISA說明書操作，使用INFINITE M200型多功能酶標儀檢測3組每組8孔吸光度A(450 nm波長)，作出標準曲線，計算各組VEGF含量。

3 結果

3.1 各組血管內皮細胞的Nrf2及HO-1 mRNA表達水平比較 與正常組比較，模型組Nrf2、HO-1 mRNA表達水平均顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，木丹顆粒組Nrf2及HO-1的mRNA表達水平均顯著上調(P<0.05)。見表2。

表2 各組血管內皮細胞的Nrf2及HO-1 mRNA表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組人血管內皮細胞的Nrf2及HO-1蛋白表達水平比較 與正常組比較，模型組Nrf2及HO-1的蛋白表達水平均顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，木丹顆粒組Nrf2及HO-1蛋白表達水平均顯著上調(P<0.05)。見圖1、表3。

注：A.正常組；B.模型組；C.木丹顆粒組

表3 各組血管內皮細胞的Nrf2及HO-1蛋白表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 各組人血管內皮細胞上清液中VEGF含量比較 與正常組比較，模型組中VEGF含量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，木丹顆粒組中VEGF含量顯著減少(P<0.05)。見表4。

表4 各組人血管內皮細胞上清液中VEGF含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

糖尿病患者AS的發(fā)病機制尚未完全闡明，有研究表明高糖環(huán)境激活的氧化應激反應和內皮細胞功能紊亂均參與AS的發(fā)生發(fā)展[10]。血管內皮細胞受到環(huán)境刺激激活氧化應激反應時，產生的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)可過度氧化血管壁中的低密度脂蛋白，觸發(fā)凋亡程序，破壞血管壁的完整性[11]。高糖刺激也可誘導超氧化物的產生，其與內皮來源的一氧化氮相互反應產生的過氧亞硝酸鹽可直接損傷血管內皮細胞的結構、形態(tài)及功能[12]。

Nrf2/ARE信號通路是調節(jié)氧化應激反應的主要信號通路[13]。Nrf2是該通路的始動激活劑[14]，ARE是人體內多種抗氧化酶均含有的一個相同啟動子序列[15]。生理狀態(tài)下，胞漿中Nrf2與果蠅激動蛋白結合蛋白結合，是無活性偶聯(lián)狀態(tài)，機體高糖環(huán)境氧化應激狀態(tài)下，Nrf2磷酸化與結合蛋白分離，轉位與特異的DNA-啟動子結合序列ARE結合[16]，產生轉錄活性，激活后續(xù)基因對HO-1、γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶、超氧化物歧化酶等的表達，抑制血管內皮細胞ROS過量產生，發(fā)揮抗氧化應激的自我保護作用，阻止動脈硬化進展。Jiménezosorio等[13]研究表明，在2型糖尿病的病理狀態(tài)下，Nrf2會上調，改善氧化應激，形成相應的保護機制。

HO-1是Nrf2/ARE信號途徑重要的下游因子，也是體內重要的抗氧化酶，具有抗氧化、抑制細胞凋亡和調節(jié)信號轉導的作用[17]。Gou等[18]發(fā)現(xiàn)上調db/db小鼠HO-1含量以減少氧化應激的發(fā)生，以達到改善內皮細胞功能、防治AS的作用。VEGF是重要的促血管生成因子之一[19]，直接參與內皮細胞的增殖遷徙和血管新生。AS的許多發(fā)病因素，如缺氧、高血糖及各種生長因子等均可加劇VEGF的合成并發(fā)揮作用[20]。VEGF在刺激血管內皮細胞增殖遷移的同時還能促進黏附因子和炎癥的表達，激活白細胞，釋放炎癥因子[21]，加重氧化應激程度。有體外細胞培養(yǎng)證實，VEGF能促使血管內皮細胞合成細胞外基質損傷血管[22]。

AS可歸屬于中醫(yī)學“脈痹”“頭痛”“胸痹”“眩暈”等疾病的范疇，其病在血脈，屬于血脈病。《醫(yī)林改錯》云：“元氣既虛，必不能達于脈管，血管無氣，必停留而瘀?！薄端貑枴づe痛論》中提出“百病生于氣”。氣的功能失常，推動無力則血行不暢，致血脈不暢，久而生瘀。現(xiàn)代中醫(yī)也將血液高凝狀態(tài)、血管壁受損、脂質斑塊形成、血栓形成等視為血瘀證，認為血脈不通，血滯阻絡易致AS。故中醫(yī)學治療AS多以益氣、活血、通絡為治療基本原則。木丹顆粒是由黃芪、三七、赤芍、川芎、紅花等組成的具有益氣活血通絡功效，用于治療周圍神經病變的上市中成藥。近期研究顯示木丹顆粒有減輕糖尿病患者血管慢性炎癥反應、降低頸動脈內膜中層厚度、抗AS等作用，對抗氧化應激、改善血管內皮功能有良好療效[23]?，F(xiàn)代研究顯示，三七能通過多種機制防治AS[24]。侯騰飛等[25]總結黃芪皂苷、川芎嗪、紅花黃色素A能調節(jié)脂質代謝、抗氧化，赤芍總苷則可保護血管內皮細胞。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組Nrf2、HO-1的表達較正常組增多，這是高糖環(huán)境下血管內皮細胞對氧化應激所做出的代償性反應。應用木丹顆粒干預后，Nrf2、HO-1的表達水平較模型組上調，這是由于抗氧化酶受藥物影響進一步活化發(fā)揮抗氧化應激作用。另外，模型組VEGF的含量明顯多于正常組，藥物干預后含量下降，可見高糖環(huán)境可刺激VEGF合成增多，而木丹顆粒能有效地抑制其含量的上調。

綜上所述，木丹顆粒在高糖環(huán)境下能通過活化Nrf2/ARE信號通路，抑制VEGF合成，減輕氧化應激，保護血管內皮細胞，以達到抗AS的作用。