吳 超，張 賽，張椿鈺，王 愷，程 明

擠壓傷(crush injury, CI)是肢體肌肉豐厚部位受到重物擠壓造成的損傷，嚴重者可引起全身多器官損傷，稱為擠壓綜合征(crush syndrome, CS)[1-2],尤以腎為最常見且最嚴重，常導致急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)，甚至急性腎衰竭(acute renal failure, ARF)，病死率極高[3-5]。隨著工業(yè)生產(chǎn)、交通工具等的自動化程度增高，人為損傷逐漸增多，加之自然災害防范困難，CI的數(shù)量并未減少，甚至有增加的趨勢[6]。近些年，關于CI的研究并未有明顯進展，當前擠壓傷的致傷機制主要集中在缺血再灌注損傷及由缺血再灌注引起的橫紋肌溶解[7]。關于其分子機制等的研究較少。臨床上CI一般都有明確的外傷史，且多數(shù)肢體有擠壓留下的壓跡，CI患者在解壓后短時間內(nèi)即可出現(xiàn)肌紅蛋白尿，實驗室檢查如血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)、血鉀、血清肌紅蛋白含量等均對CI的診斷有一定幫助。關于CI嚴重程度及預后的判斷，尚無明確臨床指標。本研究旨在通過應用蛋白質(zhì)組學方法，對CI大鼠模型血清進行檢測，篩選出其中與CI關系密切的生物大分子，以期通過觀察不同時間濃度的差異，提示CI的病程進展及預后，篩選分子靶點，為CI的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 由美國Water公司提供的高效液相色譜儀，串聯(lián)質(zhì)譜儀由賽默飛公司提供。iTRAQ相關試劑主要由美國應用生物系統(tǒng)公司、賽默飛公司及西格瑪公司提供。

1.2實驗動物分組及模型制備 選取APF級清潔雄性Wistar大鼠40只(由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院提供)，體重200～240 g，正常食水適應性喂養(yǎng)1周。將大鼠隨機分為對照組(C組)、0 h組(Z組)、12 h組(T組)、72 h組(S組)，每組10只。按照100 g體重0.3 ml 2%戊巴比妥鈉進行麻醉，麻醉后將大鼠置于武警救援醫(yī)學研究所自主研發(fā)的實驗動物擠壓平臺，對雙后肢進行擠壓，設定擠壓時間為16 h，擠壓壓力為3 kg。擠壓完成后將Z組與C組立即用戊巴比妥鈉麻醉并進行取材，其余組每只大鼠單獨分籠喂養(yǎng)進行觀察，給予正常食水。觀察時間結束時用戊巴比妥鈉麻醉并取材。

1.3樣品獲取及檢測 將大鼠麻醉后固定于鼠板開腹，取腹主動脈血約2 ml置于促凝管，輕輕混勻后冰上放置30 min，4℃、1200×g離心15 min，分離血清置于0.5 ml EP管。用BCA定量法進行蛋白定量。調(diào)整蛋白濃度后取100 μg樣品按順序進行SDS-PAGE電泳、還原烷基化和酶解、iTRAQ標記、C18反向柱分離、質(zhì)譜分析。

1.4統(tǒng)計學方法 將收集到的數(shù)據(jù)使用UniProt-Rattus norvegicus數(shù)據(jù)庫進行搜索。查庫時將raw文件提交至Proteome Discoverer服務器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫，然后進行數(shù)據(jù)庫搜索。使用R語言中的t.test函數(shù)檢驗樣本間差異顯著性P值，依據(jù)鑒定的蛋白豐度，蛋白間無顯著差異時蛋白豐度比值為1，當豐度比達到1.2倍以上(不包括1.2倍)，且經(jīng)檢驗P<0.05，即視為差異蛋白。

2 結果

2.1差異蛋白鑒定結果 本次試驗共鑒定出568個蛋白，其Z/C得到符合條件的差異蛋白206個，其中上調(diào)蛋白133個，下調(diào)蛋白73個；T/C得到357個差異蛋白，其中84個蛋白上調(diào)，273個蛋白下調(diào)；S/C得到280個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白82個，下調(diào)蛋白198個。將各組結果進行匯總篩選出變化趨勢相同的蛋白，共得到110個共同差異蛋白。剔除變化<1.5倍(包括1.5倍)的蛋白，得到上調(diào)蛋白18個，下調(diào)蛋白11個，其中包含4個未知蛋白(Uncharacterized protein)。見表1。

2.2差異蛋白表達情況

2.2.1總體表達趨勢：通過匯總各觀察時間點的蛋白表達趨勢曲線,得到總蛋白在各時間點的總體表達趨勢。擠壓傷解壓后差異蛋白總體呈現(xiàn)出先急劇變化而后逐漸回歸的趨勢，且在各觀察時間點，無論表達上調(diào)或下調(diào)，擠壓后12 h均為變化最明顯的時間點。見圖1。

2.2.2不同時間差異蛋白表達情況：上調(diào)蛋白中腺苷酸琥珀酸合成酶同工酶1、絲氨酸蛋白酶抑制劑a3n、磷酸甘油酸變位酶2、α1-酸性糖蛋白、結合珠蛋白、α2巨球蛋白、纖維連接蛋白、果糖二磷酸醛縮酶A、中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白、犁鼻2受體46與總體趨勢一致，且腺苷酸琥珀酸合成酶同工酶1上調(diào)最明顯。見圖2。下調(diào)蛋白中Igγ-2C鏈C區(qū)、盤狀蛋白，CUB和LCCL結構域蛋白2、皮質(zhì)類固醇結合球蛋白、富含亮氨酸的重復序列和免疫球蛋白樣結構域3、維生素E結合糖蛋白與下調(diào)蛋白總體趨勢一致。見圖3。RCG49849、血清白蛋白表達在各時間點表達較穩(wěn)定。

2.3差異蛋白相互作用 共同差異蛋白STRING網(wǎng)絡相互作用結果顯示，Pkm(Pyruvate kinase PKM)、Pgam2(Phosphoglycerate mutase 2)、Aldoa(Fructose-bisphosphate aldolase A)、Pygm(Alpha-1,4 glucan phosphorylase)、Serpina3n(Serine protease inhibitor A3N)、Hp(Haptoglobin)、A2m(Alpha-2-macroglobulin)、Fgg(Fibrinogen gamma chain)、Fn1(Fibronectin)、Lcn2(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)、Adssl1(Adenylosuccinate synthetase isozyme 1)、Pvalb(Parvalbumin alpha)、Serpina6(Corticosteroid-binding globulin)、Afm(Afamin )處于關鍵節(jié)點，可能與CI的發(fā)病機制及病理進程有關。見圖4。

2.4差異蛋白KEGG通路富集結果 糖酵解/糖異生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、胰高血糖素信號通路(Glucagon signaling pathway)、碳代謝(Carbon metabolism)、癌癥中的中樞碳代謝(Central carbon metabolism in cancer)均為與糖代謝有關的通路。見表2。表明CI解壓后不同時間機體糖代謝與疾病進程相關。

表1 篩選出的29個差異蛋白編號及對應名稱

圖1 4組差異蛋白總體表達趨勢
C組為對照組，Z組為擠壓后0 h組，T組為擠壓后12 h組，S組為擠壓后72 h組

圖2 4組各上調(diào)差異蛋白表達情況
C組為對照組，Z組為擠壓后0 h組，T組為擠壓后12 h組，S組為擠壓后72 h組

圖3 4組各下調(diào)差異蛋白不同觀察時間表達情況
C組為對照組，Z組為擠壓后0 h組，T組為擠壓后12 h組，S組為擠壓后72 h組

圖4 共同差異蛋白STRING相互作用網(wǎng)絡圖

表2 差異蛋白KEGG通路富集結果

3 討論

本研究結果顯示，差異蛋白在解壓后12 h達到高峰。分析原因可能與解壓后大量富氧血液流入受壓組織，導致組織再灌注損傷，造成更進一步的組織損傷有關。未解壓時，局部組織缺血、缺氧，導致代謝紊亂，細胞內(nèi)ATP大量消耗，機體局部組織依靠有氧氧化供能無法提供充足的能量，此時激活糖代謝其他途徑如糖酵解/糖異生等以滿足機體能量需求。當壓力解除后，富含氧的血液涌入受損組織，然而組織功能嚴重受損導致無法很好地利用氧，從而產(chǎn)生大量活性氧對組織進一步損傷，在短時間內(nèi)造成病情惡化[8]。

本研究結果顯示，肌酸激酶(creatine kinase，CK)在解壓即刻處于高水平，隨著解壓時間延長而降低。既往研究報道，CK作為判斷CI嚴重程度的指標之一[9]，但也有文獻提出，其不能作為判斷疾病嚴重程度的指標[10]。CK以骨骼肌和心肌含量最多，其次為腦、平滑肌和肝臟等，其主要存在于細胞質(zhì)和線粒體中，與細胞內(nèi)能量轉運、肌肉收縮、ATP再生直接相關，常用于肌病的檢測。正常狀態(tài)下由于酶蛋白分子直徑遠大于肌細胞膜孔徑，因此很少從細胞膜透出。病理狀態(tài)下血清CK水平升高,一般提示含有CK的組織細胞通透性增強或細胞破壞,尤其是骨骼肌纖維的膜通透性異常或肌纖維損傷。骨骼肌損傷、進行性肌營養(yǎng)不良、多發(fā)性肌炎和全身性驚厥時主要以肌型肌酸激酶同工酶(CK-MM)為主，腦血管意外、腦部手術、嚴重平滑肌損傷如腸梗阻可見腦型肌酸激酶同工酶(CK-BB)增高。國內(nèi)學者的研究顯示骨骼肌損傷后血清CK含量明顯增加，且與損傷的嚴重程度相關[11-12]。CI局部肌肉組織缺血缺氧，引起創(chuàng)傷性橫紋肌溶解，肌細胞崩解、纖維斷裂，大量肌細胞內(nèi)物質(zhì)釋放，再灌注發(fā)生時，隨血液進入循環(huán)，引起血清CK水平增高，與前期研究結果相一致。

實驗結果顯示，14-3-3蛋白ε在各時間點表達水平增高，隨著觀察時間延長其表達水平逐漸回落。14-3-3蛋白家族是一類廣泛存在于真核生物細胞胞漿、線粒體、高爾基體等細胞器中的酸性小分子蛋白。有研究表明，14-3-3蛋白通過與靶蛋白結合，影響靶蛋白結構、蛋白活性或穩(wěn)定性、改變蛋白在細胞中的分布來發(fā)揮作用，參與調(diào)控如細胞信號轉導、凋亡、細胞周期、細胞代謝等多種生理活動[13-14]。在諸多疾病如關節(jié)炎、惡性腫瘤、感染性疾病等多種疾病中發(fā)揮重要作用[14-17]。14-3-3蛋白還可與糖代謝、脂肪酸代謝、核酸代謝、鳥氨酸代謝及還原代謝中的關鍵酶結合，并且14-3-3蛋白可以與Akt磷酸化的PEK-2結合使PEK-2在糖酵解途徑保持激活狀態(tài)[16]。本研究中14-3-3蛋白ε表達水平增高，推測其可能通過：①維持糖酵解途徑激活狀態(tài)，為局部能量代謝障礙組織提供能量；②調(diào)節(jié)細胞凋亡，使受損組織加速破壞這兩種生物過程調(diào)節(jié)該疾病的病理進程。本實驗中14-3-3蛋白ε的表達趨勢與CK相似，根據(jù)實驗結果CK與14-3-3蛋白ε有判斷擠壓解壓時間的特性，可用于判斷疾病進程，為治療方案的建立提供參考，這仍需進行后續(xù)研究證實。

血清白蛋白由肝臟合成，具有維持血漿滲透壓、物質(zhì)轉運、解毒及維持膠體穩(wěn)定性等功能，既往研究指出血清白蛋白通過捕獲氧自由基、結合氧化活性產(chǎn)物等減輕機體損傷[18]，輸入人血清白蛋白可以改善未復蘇的內(nèi)毒素血癥大鼠的微血管灌注[19]。有研究顯示，缺血后血清白蛋白含量及其鈷結合能力下降[20-21]。本實驗結果顯示，擠壓解壓后不同時間血清白蛋白水平降低,且表達水平相對較穩(wěn)定，分析原因可能為由于CI發(fā)生后，機體肝臟直接或間接受到損傷，白蛋白合成減少，加之毛細血管通透性增強，蛋白局部滲出至組織間隙，導致白蛋白含量降低。解壓后發(fā)生缺血再灌注，同時缺血導致氧自由基大量釋放，進而導致血清白蛋白含量持續(xù)降低。在CI發(fā)生時，受擠壓個體往往營養(yǎng)供應不足，導致白蛋白合成受阻，也可能是導致其降低的原因。因此，在CI發(fā)生過程中血清白蛋白含量的變化，可能在疾病進展方面有一定參考價值。

血漿維生素E結合蛋白在解壓即刻表達水平降低并持續(xù)到12 h達到低值，72 h逐漸回升。血漿維生素E結合蛋白是一種由肝臟分泌的糖蛋白，具有維生素E特異性結合特性。既往研究顯示該糖蛋白參與炎癥和免疫反應[22]。因血漿維生素E結合蛋白、甲胎蛋白以及維生素D結合蛋白與血清白蛋白序列同源,故將其歸為血清白蛋白家族。血漿維生素E結合蛋白具有神經(jīng)保護活性，在細胞凋亡條件下和維生素E可協(xié)同增強皮質(zhì)神經(jīng)元的存活。此外，血漿維生素E結合蛋白本身也有保護皮質(zhì)神經(jīng)元的作用[23]。研究表明，血漿維生素E結合蛋白與冠心病的發(fā)生發(fā)展關系密切[24]。剔除血漿維生素E結合蛋白基因可提高胰島素的敏感性[25]。此外血漿維生素E結合蛋白與多囊卵巢綜合征患者炎癥調(diào)節(jié)過程及顱內(nèi)動脈瘤形成相關[26-27]。本實驗結果顯示，血漿維生素E結合蛋白在CI各組中顯著下調(diào)，在12 h達到低值，我們推測其水平降低與局部肌肉等軟組織損傷有關，組織細胞壞死，消耗大量血漿維生素E結合蛋白，導致其血清水平快速下降。隨著解壓時間延長，組織再灌注，組織破壞加劇，血漿維生素E結合蛋白消耗進一步增加，血清含量進一步降低，當度過這一時期，機體調(diào)節(jié)功能恢復，其濃度會出現(xiàn)回升。

從差異蛋白KEGG通路富集結果中我們得到糖代謝相關路徑在CI發(fā)生發(fā)展中起重要作用。糖代謝途徑是機體三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的共同途徑，通過糖代謝途徑將營養(yǎng)物質(zhì)轉化為能量供代謝消耗。受到創(chuàng)傷打擊時，機體發(fā)生應激，能量消耗增大，需氧量增加，加之局部能量消耗急劇增加，機體能量代謝處于相對紊亂的狀態(tài)。此時糖代謝的相關途徑尤其是糖酵解途徑增強，產(chǎn)生更多能量。通過糖異生途徑，補充能量生成所需糖。根據(jù)富集結果Aldoa、Pgam2、Pkm在CI中參與各代謝途徑，且均為糖酵解關鍵酶。Aldoa在腫瘤細胞中表達增高[28-30]。Pgam2廣泛存在于體內(nèi)多種組織，文獻顯示其與心肌梗死、腦卒中等疾病相關[31]。Pkm是糖酵解的限速酶，有研究結果顯示，Pkm在惡性腫瘤中表達升高[32-33]。

本實驗通過對CI大鼠血清進行蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，糖酵解對CI的進展有重要意義，相關糖代謝酶類Aldoa、Pgam2、Pkm及14-3-3蛋白ε、血漿維生素E結合蛋白可能對判斷疾病進程有一定參考價值，CK作為既往血液指標與疾病進程相關。血清白蛋白可能在治療CI中有一定作用，尚需進一步驗證。后續(xù)仍需擴大樣本量并對結果進行臨床驗證。