彭鵬 程然 趙逸超 祝朝前

(唐山市工人醫(yī)院肝膽外一科，河北 唐山 063000)

肝細胞性肝癌(HCC)是目前最為常見的惡性腫瘤，是全球范圍內(nèi)第三大癌癥相關(guān)性致死性疾病〔1〕。早期HCC的治療一般采取外科手術(shù)切除、射頻消融、動脈化療栓塞以及常規(guī)方案化療。然而由于HCC早期階段的無癥狀性，HCC患者表現(xiàn)出臨床癥狀往往錯過了最佳的治療階段。目前，對于HCC多采用綜合治療方案，其中抗腫瘤藥物的應(yīng)用仍然是延緩HCC疾病發(fā)展，提高患者生存質(zhì)量的常規(guī)方案。但是，對于中晚期HCC患者的治療仍表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移風(fēng)險高、預(yù)后效果差的特點，5年生存率不足5%〔2〕，因此臨床上亟待開發(fā)HCC新型治療型藥物。研究顯示，通關(guān)藤(GFR)作為天然活性藥物，具有廣泛的藥理學(xué)活性，主要表現(xiàn)為抗腫瘤、平喘、降壓、免疫抑制及保肝利尿作用〔3〕。但對于其抗腫瘤作用機制的研究尚不明確，特別是對于HCC的抗腫瘤活性仍需要深入研究和探討。本試驗主要研究通關(guān)藤對于人肝癌細胞HepG2增殖和侵襲的影響，并進一步討論其對于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-D相關(guān)腫瘤細胞增殖和侵襲的潛在調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞株HepG2(唐山市工人醫(yī)院科研中心提供)；GFR制劑(20 ml/支，批號：201806121，南京圣和藥業(yè)，商品名：消癌平，每1 ml相當(dāng)于1 g原藥材)；細胞培養(yǎng)液DMEM(GIBCO公司,美國)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；RIPA蛋白裂解液(江蘇碧云天公司)；MTT(Sigma公司)；抗體VEGF-D(Santa Cruz公司)；抗體β-Actin(Cell Signal公司)。

1.2試驗方法

1.2.1人肝癌細胞株HepG2培養(yǎng) 取人肝癌細胞株HepG2在含有10%DMEM培養(yǎng)基中(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，37℃、5%CO2飽和濕度體外培養(yǎng)，每24 h半量更換培養(yǎng)基，應(yīng)用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)，用于試驗干預(yù)處理。

1.2.2通關(guān)藤制劑藥物處理HepG2細胞 取人肝癌細胞株HepG2在含有10%DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度體外培養(yǎng)，24 h半量換液后，接種于96孔板或6孔板，隨機分為溶劑對照組、藥物干預(yù)組(10 mg/ml組、20 mg/ml組、40 mg/ml組)。

1.2.3噻唑藍(MTT)法檢測HepG2細胞增殖率 取正常培養(yǎng)人肝癌細胞株HepG2細胞接種于96孔板，各組分別給予不同處理，溶劑對照組給于等體積培養(yǎng)基，藥物干預(yù)組分別給于GFR終濃度10 mg/ml、20 mg/ml、40 mg/ml處理，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT液(3.6 mmol/L)，37℃孵育4 h，棄上清，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩溶解甲臜結(jié)晶，酶標(biāo)儀測定570 nm波長處的吸光度值，每組設(shè)定5個復(fù)孔，以對照組吸收度的均值為100%，細胞的存活率=(各樣本吸收度值-空白組吸光度值)/(對照組吸收度-空白組吸光度值)×100%。

1.2.4劃痕法檢測HepG2細胞侵襲率 取試驗細胞制備HepG2單細胞懸液，每孔1×106接種于6孔板，37℃、5%CO2條件全營養(yǎng)培養(yǎng)，待貼壁完全，設(shè)置溶劑對照組，藥物干預(yù)組(20 mg/ml)。利用tip槍頭用力均勻在培養(yǎng)皿中劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。37℃、5%CO2條件繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h測量一次細胞遷移距離，進而評價GFR針對肝癌細胞株HepG2細胞侵襲的影響。侵襲率=(劃痕面積0 h-劃痕面積24 h)/劃痕面積0 h。

1.2.5Western印跡法檢測VEGF-D表達水平 取正常培養(yǎng)人肝癌細胞株HepG2細胞接種于6孔板，設(shè)置溶劑對照組，藥物干預(yù)組(20 mg/ml)。RIPA裂解細胞，離心取上清，提取總蛋白。提取蛋白10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)分離蛋白，聚偏氟乙烯(PVDF)4℃轉(zhuǎn)膜2 h，5% TTBS(Tris-HCl緩沖液，0.1% Tween-20)室溫封閉2 h，VEGF-D抗體4℃孵育過夜，TBS-T(10 mmol/L Tris-HCl緩沖液,150 mmol/L NaCl,0.05% Tween-20)，二抗室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法處理，Image J圖像分析軟件對條帶進行定量分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS15.0進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1GFR對于人肝癌細胞株HepG2細胞增殖的影響 相比溶劑對照組〔(100±0.00)%〕，10、20、40 mg/ml GFR干預(yù)HepG2細胞24 h，細胞活力分別為(97.2±3.2)%、(87.3±4.7)%、(84.8±7.4)%，隨著藥物濃度的增大，OD值均逐漸減少，抑制HepG2細胞增殖率顯著增大。20 mg/ml組干預(yù)24 h開始抑制溶劑HepG2細胞增殖，相比溶劑對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。這說明GFR對于HepG2細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴關(guān)系。

2.2GFR對于人肝癌細胞株HepG2細胞侵襲的影響 相比溶劑對照組〔(88.7±2.8)%〕，GFR 20 mg/ml組〔(54.5±2.4)%〕能夠顯著性抑制HepG2細胞侵襲。見圖1。

2.3Western印跡法檢測VEGF-D在人肝癌細胞株HepG2細胞的表達 給予GFR干預(yù)處理24 h后，相比溶劑對照組細胞，VEGF-D表達顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 GFR對人肝癌細胞株HepG2細胞VEGF-D表達的影響

與溶劑對照組比較：1)P<0.05

1～4：溶劑對照12 h，GFR 12 h，溶劑對照24 h，GFR 24 h圖2 GFR對于人肝癌細胞株HepG2細胞VEGF-D表達的影響

3 討 論

腫瘤增殖和侵襲是一個多因素的發(fā)展過程，涉及原發(fā)病灶的形成，細胞脫落，血管生成等多個環(huán)節(jié)。其中抑制腫瘤血管的生成已經(jīng)成為近年來抗腫瘤研究的熱點領(lǐng)域，特別是針對HCC腫瘤發(fā)展起重要調(diào)控作用。相關(guān)研究報道，VEGF-D參與并促進了轉(zhuǎn)移灶的形成〔4〕。有研究顯示，VEGF-D在肝內(nèi)皮細胞增殖和侵襲方面起重要調(diào)節(jié)作用，還與淋巴管的新生和發(fā)展聯(lián)系緊密〔5〕。研究顯示，VEGF-D是激活腫瘤血管生成的重要信號通路，還是轉(zhuǎn)移灶形成過程中的重要步驟及腫瘤轉(zhuǎn)移后發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子〔6,7〕。因此探索調(diào)控VEGF-D的有效途徑對于開發(fā)HCC治療型藥物意義重大。

GFR為蘿藦科牛奶菜屬植物，主要分布在中國貴州、云南、福建等地，在當(dāng)?shù)孛耖g癌癥治療上有不錯效果。研究發(fā)現(xiàn)，通關(guān)藤具有免疫調(diào)節(jié)、保肝利尿、敗毒抗癌等功效〔3〕。有文獻報道，GFR對于胃癌〔8〕、食管癌〔9〕、腸癌〔10〕等表現(xiàn)出明顯的抑制增殖作用，但是尚未闡明GFR的抗腫瘤機制。本研究主要是討論GFR對于人肝癌HepG2細胞功能的影響，主要從細胞增殖和侵襲兩個方面開展研究，并深入討論其調(diào)控機制。本試驗研究結(jié)果顯示，GFR對于人肝癌細胞株HepG2細胞增殖具有顯著的抑制作用。表明GFR作為天然抗腫瘤活性藥物，對于人肝癌細胞株HepG2細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴關(guān)系。GFR處理24 h能夠明顯抑制HepG2細胞侵襲。表明，通關(guān)藤在調(diào)控HepG2細胞增殖和侵襲方面均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。GFR顯著性的抑制HepG2細胞VEGF-D的表達，隨著干預(yù)時間延長，VEGF-D的表達逐漸降低，當(dāng)給藥時間到達24 h，VEGF-D的表達水平相比對照組出現(xiàn)顯著性降低。

綜上所述，VEGF-D參與腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移灶的形成，HCC腫瘤細胞HepG2過表達VEGF-D，這種由VEGF-D所介導(dǎo)的HepG2細胞增殖和侵襲能夠被GFR所逆轉(zhuǎn)。結(jié)合本研究試驗結(jié)果，GFR抑制HepG2細胞增殖和侵襲的同時伴隨著VEGF-D表達的顯著降低。本試驗結(jié)果為HCC抗腫瘤治療提供潛在的治療可能，特別是針對高轉(zhuǎn)移風(fēng)險高、不良預(yù)后效果的HCC腫瘤的治療提供重要理論依據(jù)。