馬寶豐 李鐵成 徐芳

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科，遼寧 錦州 121001)

乳腺癌發(fā)生于乳腺腺上皮組織，近年來(lái)女性乳腺癌發(fā)病率和死亡率都呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性健康〔1〕。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年世界乳腺癌新發(fā)病患者約240萬(wàn)例，死于乳腺癌的患者約52萬(wàn)例〔2〕。外科手術(shù)治療、放化療、靶向治療、內(nèi)分泌治療等多種乳腺癌臨床治療方式雖可降低患者死亡率、延長(zhǎng)患者生存期，但治療后出現(xiàn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及放化療的毒副作用是乳腺癌導(dǎo)致患者治療效果不佳的主要原因〔3～5〕。麻醉藥在乳腺癌手術(shù)治療中廣泛應(yīng)用，現(xiàn)如今越來(lái)越多的研究關(guān)注于麻醉鎮(zhèn)痛藥物與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，臨床研究結(jié)果顯示，曲馬多可、咖啡酸苯乙酸酯、雷諾嗪等麻醉類藥物對(duì)乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用〔6～8〕。普魯卡因(PCA)是傳統(tǒng)的化療藥物之一，在手術(shù)中也作為局部麻醉劑使用，在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，PCA能夠使肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在G0/G1期，從而顯著抑制癌細(xì)胞的增殖，并具有劑量、時(shí)間依賴效應(yīng)〔9〕。本研究擬探討PCA對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 MCF-7人乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自ATCC；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；Transwell小室購(gòu)自Corning公司；噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑、結(jié)晶紫、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；兔抗人蛋白激酶B(AKT)3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abbiotec公司；兔抗人GAPDH多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購(gòu)自Abcam公司；control mimic和miR-15a-5p mimic、control inhibitor和miR-15a-5p inhibitor購(gòu)自廣州瑞博生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每天換新鮮培養(yǎng)液一次，待細(xì)胞融和至70%左右時(shí)使用胰蛋白酶消化傳代。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞使用0.25%胰蛋白酶消化后重懸，以1×105個(gè)/孔接種至24孔板，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書分別將control mimic、miR-15a-5p mimic、control inhibitor、miR-15a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞，記為miR-NC組、miR-15a-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-15a-5p組；選擇轉(zhuǎn)染control inhibitor和miR-15a-5p inhibitor的細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入PCA并調(diào)整終濃度為5.0 mmol/L，常規(guī)培養(yǎng)48 h。

將MCF-7細(xì)胞隨機(jī)分為Con組、不同濃度PCA處理(0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、10 mmol/L)組、PCA組。處理方法：Con組不添加PCA；不同濃度PCA處理組在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入PCA并調(diào)整終濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L；PCA組：以含終濃度為5.0 mmol/L PCA的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。每組6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 在各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)加入20 μl的MTT(5 g/L)溶液；孵育4 h后，去除多余培養(yǎng)液，加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩反應(yīng)10 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的各組吸光度值(OD)。每組設(shè)6個(gè)重復(fù)。

1.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其制備成1×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取200 μl細(xì)胞懸液接種到Transwell小室上室中，下室加入600 μl含10 % 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗滌，甲醇固定30 min，0.1 %結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌，自然風(fēng)干后隨機(jī)選6個(gè)視野觀察穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)，取均值。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：以1∶5比例加入DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室的上室，風(fēng)干成膠后，按照上述操作方法操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細(xì)胞。

1.6qRT-PCR檢測(cè)miR-15a-5p表達(dá)量 取MCF-7細(xì)胞和PCA(5.0 mmol/L)處理的MCF-7細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，置于實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣品重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)2-△△Ct法分析結(jié)果。內(nèi)參引物序列如下：GAPDH反義：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，正義：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

1.7Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入RIPA裂解液裂解，4 ℃，10 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5 % 脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入AKT3抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜；加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，電化學(xué)發(fā)光顯影，每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) Targetscan在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)AKT3 3′-非翻譯區(qū)(UTR)上存在miR-15a-5p的結(jié)合位點(diǎn)，為進(jìn)一步驗(yàn)證AKT3是否是miR-15a-5p的靶基因，構(gòu)建野生型AKT3-3′UTR(WT)和突變型AKT3-3′UTR(MUT)的全長(zhǎng)質(zhì)粒載體，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書分別與miR-15a-5p mimic共轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)熒光強(qiáng)度=螢火蟲熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PCA對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與Con組相比，隨著PCA濃度的增加，MCF-7細(xì)胞24 h、48 h、72 h的抑制率逐漸增強(qiáng)。選用作用時(shí)間48 h，抑制率約為50%的PCA濃度(5.0 mmol/ml)用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表1。與Con組相比，PCA組MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲量均顯著降低(P<0.001)。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度PCA對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制率的影響

與Con組比較:1)P<0.05

表2 PCA對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲的影響個(gè))

2.2PCA對(duì)miR-15a-5p表達(dá)的影響 與Con組(1.13±0.01)相比，PCA組miR-15a-5p的表達(dá)量(1.82±0.13)顯著增加(t=9.166,P<0.01)。

2.3miR-15a-5p對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-15a-5p組MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率顯著升高，細(xì)胞的遷移和侵襲量顯著降低(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miR-15a-5p對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲、增殖的影響

2.4抑制miR-15a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了PCA對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的抑制作用 與Con組相比，PCA組的MCF-7細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，細(xì)胞遷移和侵襲量顯著降低(P<0.05)；將miR-15a-5pinhibitor轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞并經(jīng)PCA處理后，與PCA+anti-miR-NC組相比，PCA+anti-miR-15a-5p組的MCF-7細(xì)胞增殖抑制率明顯降低，細(xì)胞遷移和侵襲量顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 抑制miR-15a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了PCA對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的抑制作用

與Con組比較:1)P<0.05；與PCA+anti-miR-NC組比較:2)P<0.05

2.5AKT3為miR-15a-5p的靶基因 Targetscan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-15a-5p與AKT3之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果如表5所示：與miR-NC組比較，共轉(zhuǎn)染miR-15a-5p mimic和AKT3 3′UTR-WT野生型載體的MCF-7細(xì)胞，熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染miR-15a-5p mimic和AKT3 3′UTR-MUT突變型載體的MCF-7細(xì)胞，熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。將miR-15a-5p mimic、miR-15a-5pinhibitor轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，與miR-NC組(0.61±0.06)相比，miR-15a-5p組的MCF-7細(xì)胞AKT3蛋白表達(dá)量(0.22±0.03)顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.51±0.05)相比，anti-miR-15a-5p組的MCF-7細(xì)胞AKT3蛋白表達(dá)量(0.93±0.09)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.6抑制miR-15a-5p的表達(dá)恢復(fù)PCA對(duì)MCF-7細(xì)胞中AKT3蛋白表達(dá)的抑制作用 與Con組(1.06±0.11)相比，PCA組的MCF-7細(xì)胞中AKT3蛋白的表達(dá)量(0.47±0.03)顯著降低(P<0.05)；與PCA+anti-miR-NC組(0.42±0.03)相比，PCA+anti-miR-15a-5p組的MCF-7細(xì)胞中AKT3蛋白的表達(dá)量(0.76±0.06)顯著升高(P<0.05)。提示，抑制miR-15a-5p恢復(fù)了PCA對(duì)MCF-7細(xì)胞AKT3蛋白表達(dá)的抑制作用。見(jiàn)圖3。

圖1 AKT3的3′UTR中含有miR-15a-5p的互補(bǔ)核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-NC組,miR-15a-5p組,anti-miR-NC組,anti-miR-15a-5p組圖2 各組AKT3蛋白的表達(dá)

圖3 各組AKT3蛋白的表達(dá)

3 討 論

我國(guó)2015年乳腺癌新發(fā)病例約27萬(wàn)，占全國(guó)惡性腫瘤的15%，死亡7萬(wàn)例〔10〕。目前手術(shù)切除仍然是乳腺癌的主要治療手段，有可能造成癌細(xì)胞種植、增生和轉(zhuǎn)移，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，麻醉藥物與腫瘤細(xì)胞直接作用可影響腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，對(duì)化療藥物的敏感性也有影響〔11〕。PCA是常用的局部麻醉藥物之一，在某些癌癥中被證明是一種潛在的DNA甲基化抑制劑，甲基化水平增高可使抑癌基因失活，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)〔12〕。在胃癌〔13〕、結(jié)腸癌〔14〕中，PCA顯著降低了整體DNA甲基化水平，并對(duì)癌細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)的作用，從而抑制癌癥的發(fā)展。PCA可將乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231阻滯在S期，降低細(xì)胞存活率，抑制其遷移〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)，PCA對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈濃度、時(shí)間依賴性；PCA(5.0 mmol/L)處理的MCF-7細(xì)胞其遷移和侵襲量均明顯降低。

microRNA是在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度為21-25nt的非編碼小分子RNA，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞周期調(diào)控等多個(gè)環(huán)節(jié)，并且miRNA在導(dǎo)致細(xì)胞癌變及癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等各階段具有關(guān)鍵作用〔16〕。miR-15a-5p是miR-15家族的一個(gè)成員，由位于染色體13q14區(qū)域內(nèi)的基因編碼，以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中明顯低表達(dá)，miR-15a可通過(guò)靶向于抗凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡〔17〕。多項(xiàng)研究表明，miR-15a-5p在子宮內(nèi)膜癌〔18〕、肺癌〔19〕、肝癌〔20〕的組織及細(xì)胞中均呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-15a-5p可抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移能力及癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)，PCA處理的MCF-7細(xì)胞中miR-15a-5p的表達(dá)水平顯著上調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-15a-5p可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；將miR-15a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞并經(jīng)PCA處理后，MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著提高。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，AKT家族主要包括AKT1、AKT2、AKT3三種亞型，AKT是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號(hào)通路下游的主要效應(yīng)分子，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔21〕。AKT作為一種原癌基因，已成為醫(yī)學(xué)界的關(guān)注熱點(diǎn)，在乳腺癌的研究中，AKT3過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖，增加癌細(xì)胞致瘤性〔22〕。本研究通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)了AKT3是miR-15a-5p的靶基因，并運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-15a-5p與AKT3之間的靶向關(guān)系。PCA處理的MCF-7細(xì)胞中AKT3表達(dá)下調(diào)，抑制miR-15a-5p恢復(fù)了PCA對(duì)MCF-7細(xì)胞AKT3表達(dá)的抑制作用。

綜上，PCA能夠抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖、遷移和侵襲能力，可能是通過(guò)調(diào)控miR-15a-5p/PI3K-AKT3途徑的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。