張利芳 王云華 郝艷梅 何珊

(1包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2包頭市腫瘤醫(yī)院檢驗科；3包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科)

硒蛋白(Sel)S是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種跨膜蛋白，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥和免疫等重要功能。SelS在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起作用，如心血管疾病、2型糖尿病、炎癥、阿爾茨海默病等。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SelS基因的多種單核苷酸多態(tài)性與心血管疾病、腫瘤等密切相關(guān)〔1,2〕。本課題擬探討食管癌患者SelS基因遺傳易感性與相關(guān)危險因素的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2016年12月至2017年6月在包頭市腫瘤醫(yī)院、包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院經(jīng)臨床組織病理學(xué)確診的新發(fā)漢族食管癌患者124例為病例組，其中男100例，女24例，平均年齡(65.17±0.79)歲。收集同期社區(qū)健康對照者132例為對照組，其中男105例，女27例，平均年齡(65.21±0.83)歲，經(jīng)問卷調(diào)查排除冠心病、高血壓、糖尿病、其他惡性腫瘤和消化系統(tǒng)疾病患者。同時記錄兩組吸煙、飲酒情況(吸煙準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)：每天1支以上，時間超過6個月；飲酒標(biāo)準(zhǔn)：平均每周1次，時間超過1年)。病例組和對照組年齡和性別匹配(年齡：t=0.621，P=0.975；性別：χ2=0.048，P=0.876)。

1.2實驗試劑、儀器 血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、50 bp DNA Marker(北京天根公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國Veriti，96 Well)。

1.3基因組DNA提取與引物合成 采集研究對象空腹乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血2 ml提取血液基因組DNA。通過Pubmed-SNP數(shù)據(jù)庫查詢SelS基因G-254A(rs34713741)兩側(cè)基因序列，應(yīng)用軟件Primer premier5.0設(shè)計引物(表1)。

表1 SelS基因rs34713741位點引物設(shè)計

特異性內(nèi)引物F1和R1分別在3′端倒數(shù)第3位引入1個人為的錯配堿基(劃線部分)以便于增加分型的特異性。F1和R2組合檢測T等位基因，其PCR產(chǎn)物大小為122 bp。F2和R1組合檢測C等位基因，其PCR產(chǎn)物大小為221 bp。外引物F2和R2組合擴(kuò)增出的PCR片段大小為302 bp，作為陽性對照。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4四引物擴(kuò)增阻礙突變體系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)擴(kuò)增 反應(yīng)體系為25 μl，包括：DNA模板6 μl(約100 ng)，F(xiàn)2和R2(10 μmol/L)各0.4 μl，F(xiàn)1和R1(10 μmol/L)各0.8 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl，去離子水4.1 μl。PCR條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于2.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。隨機(jī)選取50個PCR產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測序驗證，所用引物為表1中的F2和R2，PCR體系為50 μl，包括：DNA模板12 μl(約100 ng)，F(xiàn)2和R2(10 μmol/L)各2 μl，2×Taq PCR Master Mix 25 μl，去離子水9 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗、χ2檢驗，非條件Logistic回歸分析計算風(fēng)險比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)。

2 結(jié) 果

2.1Tetra-primer ARMS-PCR基因分型結(jié)果 PCR后可見3種基因型：302 bp、221 bp和122 bp 3條帶為CT型，302 bp、122 bp兩條帶為CC型，302 bp、221 bp兩條帶為TT型，見圖1。

2.2SelS基因G-254A位點基因測序結(jié)果 SelS基因G-254A位點3種基因型測序結(jié)果與Tetra-primer ARMS-PCR結(jié)果一致，見圖2。

1，3，7：TT型；2：CT型；4～6：CC型；M：50 bp Marker圖1 SelS基因G-254A位點基因分型

A：CC型；B：TC型；C：TT型；橫線部分為限制性內(nèi)切酶識別序列，箭頭所指為SelS基因G-254A位點堿基圖2 SelS基因G-254A位點基因測序結(jié)果

2.3SelS基因G-254A位點基因型和等位基因頻率分布 病例組與對照組CC、CT、TT基因型分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002，OR=2.029，95%CI：1.361～3.025)；等位基因C、T分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000，OR=2.005，95%CI：1.363～2.951)，見表2。

2.4兩組吸煙人群SelS基因G-254A位點基因型和等位基因分布 兩組吸煙人群CC、CT和TT基因型分布頻率比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.005，OR=2.898，95%CI：1.478～5.685)；等位基因C、T分布有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002，OR=2.611，95%CI：1.410～4.835)，說明吸煙與SelS基因G-254A位點基因突變交互作用增加食管癌患病風(fēng)險，見表3。

2.5兩組飲酒人群SelS基因G-254A位點基因型和等位基因分布 兩組飲酒人群CC、CT、TT基因型分布比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.086，OR=2.052，95%CI：1.704～3.918)；等位基因C、T分布比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.051，OR=1.746，95%CI：0.994～3.068)，說明飲酒與SelS基因G-254A位點基因多態(tài)性無相關(guān)性，見表4。

2.6食管癌危險因素多因素Logistic回歸分析 吸煙、飲酒和基因突變是食管癌發(fā)病的風(fēng)險因素(均P<0.1)，見表5。

表2 SelS基因G-254A位點基因型、等位基因分布〔n(%)〕

表3 兩組吸煙人群 SelS基因G-254A位點基因型、等位基因分布〔n(%)〕

表4 兩組飲酒人群 SelS基因G-254A位點基因型、等位基因分布〔n(%)〕

表5 食管癌危險因素多因素Logistic回歸分析

3 討 論

相關(guān)體外細(xì)胞實驗表明SelS細(xì)胞質(zhì)區(qū)域具有硫氧還原蛋白(Trx)依賴的還原酶活性調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡，有效降低細(xì)胞內(nèi)高活性分子如活性氧簇(ROS)的水平，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷；并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，SelS與p97三磷酸腺苷(ATP)酶(也稱為VCP)、Derlin伴侶蛋白、E3泛素連接酶和SelK共同組成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解過程復(fù)合體，促進(jìn)未(或錯誤)折疊蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)被降解，從而有效減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激〔1〕。此外，體外和體內(nèi)細(xì)胞實驗均揭示SelS基因啟動子區(qū)域中有兩個與核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB結(jié)合的位點，參與調(diào)節(jié)血漿中炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1、 IL-6等的表達(dá)〔1，3〕。SelS是人體內(nèi)非常重要的蛋白，不僅參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥等，還參與細(xì)胞免疫、甲狀腺激素代謝等。缺硒或硒中毒與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如心血管疾病、糖尿病、腫瘤、免疫和甲狀腺功能低下等〔1～6〕。最近研究發(fā)現(xiàn)還具有很強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，其基因變異將會影響功能的發(fā)揮，繼而導(dǎo)致機(jī)體抵抗致癌物的功能降低〔7〕。

目前，關(guān)于SelS基因多態(tài)性與相關(guān)疾病易感性的關(guān)聯(lián)研究主要包括15個多態(tài)性位點，但主要集中在G-105A(rs28665122)和G-254A(rs34713741)兩個位點。SelS基因多態(tài)性被認(rèn)為與消化道腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)〔7〕。Sutherland等〔8〕對結(jié)腸直腸癌患者SelS基因的G-254A多態(tài)性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示G-254A多態(tài)性位點與結(jié)腸直腸癌的發(fā)病風(fēng)險有相關(guān)性，T等位基因為風(fēng)險等位基因。毛華杰等〔9〕檢測胃癌患者SelS基因G-105A和G-254A位點多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)攜帶T等位基因的個體患胃癌的風(fēng)險是CC基因型個體的1.89倍(OR=1.89，95%CI：1.10～3.23)。張龍等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)SelS基因(rs34713741位點)CT基因型相比于CC型患結(jié)直腸癌的風(fēng)險升高(OR=1.597，95%CI：1.096～2.326)。邢少姬等〔11,12〕發(fā)現(xiàn)攜帶T等位基因的個體患胃癌、肝癌的風(fēng)險增加。本研究提示吸煙人群罹患食管癌的風(fēng)險是不吸煙人群的1.782倍，飲酒人群風(fēng)險是正常人的1.594倍，SelS基因多態(tài)性是食管癌的遺傳易感因素。這也說明了食管癌是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。

本研究說明SelS基因G-254A位點多態(tài)性與內(nèi)蒙古漢族人群食管癌的發(fā)病風(fēng)險存在相關(guān)性，T等位基因可能是該人群食管癌發(fā)病的危險因素之一。據(jù)研究吸煙人群比不吸煙者更多地發(fā)生 p53 突變，大量吸煙與食管鱗癌患者中 p53 突變呈正相關(guān)，吸煙頻率和持續(xù)時間增加了p53 基因突變的風(fēng)險性〔13〕。本研究結(jié)果提示吸煙與基因突變交互作用可提高食管癌患病風(fēng)險，從而進(jìn)一步證明了遺傳與環(huán)境的交互作用對食管癌的影響。