丁一 趙偉峰 李波 周焯家 郭濤 簡(jiǎn)月奎

(貴州省人民醫(yī)院骨科，貴州 貴陽(yáng) 550002)

脊柱骨質(zhì)疏松是較為常見的骨質(zhì)疏松類型，早期治療手段主要包括藥物治療及支具佩戴治療，但藥物治療見效慢，在發(fā)病期間快速提高患者骨強(qiáng)度的難度較大，患者仍有較高的骨折坍塌風(fēng)險(xiǎn)，故找到一種能夠快速改善患者骨密度、增強(qiáng)脊柱椎體檢融合、減少坍塌發(fā)生的治療方法尤為關(guān)鍵且迫切〔1,2〕。隨著納米骨漿這種新骨組織功能及材料的出現(xiàn)，為脊柱骨質(zhì)疏松性壓縮骨折的治療帶來(lái)新的突破〔3〕。納米骨漿是一種能體現(xiàn)出高度仿生特性的材料，結(jié)晶羥基磷灰石、磷酸鈣是其主要成分，可代替骨組織，有著極高的生物相容性與吸收性〔4,5〕。研究表明，將BMP-2真核質(zhì)粒與納米骨漿融合后，形成的基因釋放系統(tǒng)成骨效能更佳，骨質(zhì)量高〔6,7〕。但目前國(guó)內(nèi)外并未將該系統(tǒng)作為常用材料用于脊柱骨質(zhì)疏松性壓縮骨折治療，且相關(guān)研究也較少見。本研究旨在觀察BMP-2基因活化納米骨漿促脊柱椎體間融合的價(jià)值，以期為未來(lái)BMP-2基因活化納米骨漿的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2018年1月，取20只雌性山羊，年齡5～7〔平均(6.41±0.25)〕歲；體重35～45 kg，平均(39.45±2.14)kg。

1.2納米骨漿 由Cem Ostetic TM，Berkeley Advanced Biomaterials公司提供。

1.3pIRES-hBMP-2/真核表達(dá)載體 由華中科技大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，制備質(zhì)粒后提取定量，經(jīng)無(wú)菌蒸餾水稀釋保存。

1.4血液生化指標(biāo) 取山羊血，經(jīng)處理后取血清放至有促凝劑的生化采血管內(nèi)，檢測(cè)骨鈣素、堿性磷酸酶表達(dá)。

1.5Micro CT掃描 山羊椎體離解至單個(gè)，去除周圍組織、肌肉等成分，經(jīng)環(huán)鉆鉆取椎體松質(zhì)骨，掃描分析皮質(zhì)骨，制作環(huán)形皮質(zhì)骨，21 μm分辨率，5個(gè)樣本為1組掃描，后重建分析。

1.6生物力學(xué) 對(duì)椎體與股骨髁松質(zhì)骨經(jīng)軸向加壓測(cè)量其力學(xué)強(qiáng)度，測(cè)量時(shí)在加壓磨具內(nèi)置入圓錐形椎體骨塊，施加壓力逐漸將其壓縮至椎體長(zhǎng)度50%。

1.7模型構(gòu)建與觀察指標(biāo)

1.7.1構(gòu)建成效 觀察BMP-2基因活化納米骨漿構(gòu)建情況，看其是否符合本次實(shí)驗(yàn)的要求。

1.7.2椎體最大載荷 隨機(jī)抽取15具椎體，Micro CT掃描測(cè)定60個(gè)椎體的骨密度，保證其在椎體骨密度一致的條件下，將其隨機(jī)分為3組，包括空白對(duì)照組(n=30)、納米骨漿組(n=15)、BMP-2基因活化納米骨漿組(n=15)。在C型臂X線機(jī)引導(dǎo)下，分別經(jīng)雙側(cè)椎弓根為納米骨漿組與BMP-2基因活化納米骨漿組填充納米骨漿及BMP-2基因活化納米骨漿，后壓縮全部椎體高度為原始高度50%，對(duì)比3組模型脊柱椎骨最大壓縮應(yīng)力與最大載荷。

1.7.3血液生化指標(biāo) 將20只雌性山羊使用Micro CT掃描，確認(rèn)其山羊骨密度一致后，隨機(jī)分為正常組(n=5)、假手術(shù)組(n=5，開腹后便將切口縫合)、雙側(cè)卵巢切除術(shù)組(n=10，將山羊雙側(cè)卵巢切除)。分別于術(shù)前、術(shù)后6個(gè)月檢測(cè)山羊血清內(nèi)骨鈣素與堿性磷酸酶表達(dá)。術(shù)后6個(gè)月檢測(cè)雙側(cè)卵巢切除組骨密度及骨小梁結(jié)構(gòu)，保證其骨密度降低、骨小梁稀疏發(fā)生，構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型。

1.7.4雙基因活化納米骨漿用于骨質(zhì)疏松效果觀察 選取骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建成功的雙側(cè)卵巢切除山羊每只L2～L6椎體，麻醉后向其中4只經(jīng)椎弓根填充納米骨漿，其他4只填充BMP-2基因活化納米骨漿，其他2只作為空白對(duì)照組不注射納米骨漿。注射成功后4個(gè)月將山羊處死，將椎體取出后檢測(cè)其骨密度及結(jié)構(gòu)力學(xué)強(qiáng)度，檢測(cè)并對(duì)比各組脊柱椎體最大壓縮應(yīng)力及最大壓縮載荷。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BMP-2基因活化骨漿構(gòu)建情況 使用購(gòu)自華中科技大學(xué)BNP-2基因活化骨漿開展RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示BMP-2基因活化骨漿BMP-2水平表達(dá)明顯增加，與實(shí)驗(yàn)要求相符。其中空白對(duì)照組30個(gè)椎體平均BMP-2相對(duì)表達(dá)為(1.02±0.24)，基因活化的納米骨漿15個(gè)，椎體平均BMP-2相對(duì)表達(dá)為(5.21±0.85)?；蚧罨募{米骨漿表達(dá)明顯較空白對(duì)照組增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.309，P<0.01)。

2.2椎體最大載荷比較 BMP-2基因活化納米骨漿組最大壓縮應(yīng)力、最大壓縮載荷均顯著高于空白對(duì)照組與納米骨漿組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白對(duì)照組與納米骨漿組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同山羊模型脊柱椎體最大載荷比較

與空白對(duì)照組比較：1)P=0.516,2)P=0.085;3)P=0.003,4)P<0.001;與納米骨漿組比較：5)P=0.039,6)P=0.033

2.3各山羊模型組血液生化指標(biāo)水平表達(dá)比較 術(shù)前，正常組、假手術(shù)組、雙側(cè)卵巢切除術(shù)組山羊模型血清骨鈣素、堿性磷酸酶水平表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后6個(gè)月，雙側(cè)卵巢切除術(shù)組山羊模型血清骨鈣素、堿性磷酸酶水平表達(dá)均較其他兩組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；正常組與假手術(shù)組術(shù)后6個(gè)月血清骨鈣素、堿性磷酸酶水平較術(shù)前未見明顯變化，且組間表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。術(shù)后6個(gè)月，選擇正常組與雙側(cè)卵巢切除術(shù)組山羊模型中1只動(dòng)物進(jìn)行Micro CT掃描，結(jié)果顯示雙側(cè)卵巢切除術(shù)組山羊模型骨密度顯著降低，骨小梁稀疏，骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建成功。見圖1～2。

2.4雙基因活化納米骨漿用于骨質(zhì)疏松山羊模型對(duì)脊柱椎體載荷的影響觀察 3組骨質(zhì)疏松山羊模型中，BMP-2基因活化納米骨漿組最大壓縮應(yīng)力、最大壓縮載荷最高，其次為納米骨漿組，空白對(duì)照組最低，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。在納米骨漿注射后4個(gè)月，將山羊模型處死后，選擇納米骨漿組與BMP-2基因活化納米骨漿組各1只山羊模型，將其椎體取出檢測(cè)骨密度及結(jié)構(gòu)力學(xué)強(qiáng)度，結(jié)果顯示，較納米骨漿組，BMP-2基因活化納米骨漿組山羊模型脊柱椎體骨密度、最大壓縮應(yīng)力均增加，椎骨小梁致密程度好，且孔隙率更低。見圖3、4。

表2 各山羊模型組血液生化指標(biāo)水平表達(dá)比較

與同組術(shù)前比較：1)P<0.05；與正常組比較：2)P=0.706,3)P=0.102,4)P=0.756,5)P=0.742,6)P=0.767,7)P<0.001,8)P=0.502,9)P=0.002；與假手術(shù)組比較：10)P=0.560,11)P<0.001,12)P=0.642,13)P=0.015

圖1 正常組三維重建圖像

圖2 雙側(cè)卵巢切除術(shù)組三維重建圖像

表3 3組骨質(zhì)疏松山羊模型脊柱椎體載荷比較

與空白對(duì)照組比較：1)P=0.041,2)P=0.024,3)P=0.008,4)P=0.002;與納米骨漿組比較：5)P=0.046,6)P=0.037

圖3 骨質(zhì)疏松山羊模型注射納米骨漿4個(gè)月后三維重建圖

圖4 骨質(zhì)疏松山羊模型注射BMP-2基因活化納米骨漿4個(gè)月后三維重建圖

3 討 論

目前，經(jīng)椎弓根內(nèi)固定技術(shù)已成為脊柱內(nèi)固定鄰域的重要內(nèi)容，椎弓根螺釘可經(jīng)牽引、加壓及旋轉(zhuǎn)等方式為脊柱提供理想矯治，從而幫助脊柱獲得接近正常的解剖位置〔8〕。椎弓根螺釘獲得的骨-螺釘界面握力是否足夠決定了椎弓根螺釘固定的優(yōu)越性，且提供的握力應(yīng)持續(xù)至椎體骨性融合完全達(dá)到穩(wěn)定，椎弓根螺釘固定成敗取決于椎弓根螺釘置入成功與否〔9〕。但目前，在實(shí)際臨床工作中，接受椎弓根螺釘固定者多為老年患者，這類患者常合并不同程度骨質(zhì)疏松，骨質(zhì)疏松的存在在一定程度上可降低椎弓根螺釘固定能力，致使螺釘松動(dòng)，導(dǎo)致椎體間融合失敗〔10，11〕。

為解決骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的椎弓根螺釘強(qiáng)度不佳等情況，臨床常常通過(guò)增加螺釘長(zhǎng)度與直徑、對(duì)釘?shù)肋M(jìn)行不攻絲或預(yù)攻絲、釘?shù)澜?jīng)骨質(zhì)填充、使用骨水泥等材料填充釘?shù)赖确椒▉?lái)提高椎弓根的固定強(qiáng)度，但這些手段依然有其不足之處，無(wú)法達(dá)到臨床預(yù)期〔12，13〕。骨質(zhì)疏松不僅會(huì)影響到椎弓根螺釘強(qiáng)度，同時(shí)患者本身也極易發(fā)生各種骨改變，如骨小梁減少、骨質(zhì)減少、骨小梁間隙增加等，因骨小梁減少，故合并骨質(zhì)疏松的人群較其他人更容易發(fā)生骨折〔14，15〕?；蚣{米骨漿是將基因與納米骨漿向融合并經(jīng)基因真核表達(dá)載體所構(gòu)建的一種納米骨漿的延續(xù)，構(gòu)建出來(lái)的填充物同時(shí)擁有基因及納米骨漿自身優(yōu)勢(shì)〔16，17〕。具有高仿生特性的納米骨漿，在使用后一方面能創(chuàng)造適宜微環(huán)境為膠原與礦物質(zhì)沉積提供條件，一方面可推動(dòng)成骨細(xì)胞的黏附，加速細(xì)胞與生物材料間的交互作用，幫助成骨細(xì)胞分化，在納米骨漿基礎(chǔ)上加入BMP-2載體，獲得的生物材料在植入后能夠發(fā)揮理想的生物學(xué)效應(yīng)，增加成骨細(xì)胞生成能力〔18～20〕。

本研究結(jié)果提示BMP-2基因活化納米骨漿的注射能夠顯著增加椎骨對(duì)外界壓力的承受能力。提示，BMP-2基因活化納米骨漿較普通納米骨漿對(duì)合并骨質(zhì)疏松的骨折患者椎體成形術(shù)脊柱椎體間融合的影響更好。但值得注意的是，因該技術(shù)尚未被過(guò)多用于臨床實(shí)際，研究結(jié)果的真實(shí)性尚無(wú)較多循證依據(jù)可以支持，結(jié)論的可靠性還應(yīng)在未來(lái)展開相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究加以證實(shí)。

綜上所述，BMP-2基因活化納米骨漿較普通納米骨漿更利于提高脊柱椎體骨密度及生物力學(xué)強(qiáng)度，在促進(jìn)脊柱椎體間融合方面應(yīng)用價(jià)值高，可作為合并骨質(zhì)疏松骨折患者椎體成形術(shù)理想的填充材料。