朱繼田 李倩 謝后田 祖雪芹 黃偉 黃濤

(宿州市立醫(yī)院心血管內(nèi)科，安徽 宿州 234000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)發(fā)生、發(fā)展與冠脈血管壁組織中的炎癥反應(yīng)明顯相關(guān)〔1〕；炎癥反應(yīng)可促進(jìn)免疫細(xì)胞和血小板在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附和激活，導(dǎo)致內(nèi)部出血或斑塊破裂，繼發(fā)性血栓形成，引發(fā)不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死的發(fā)生〔2〕。黏蛋白結(jié)構(gòu)域的分子(Tim)3是動脈硬化的負(fù)調(diào)控因子，可提升調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性，下調(diào)效應(yīng)性T細(xì)胞活性，抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成〔3〕。但關(guān)于Tim3在冠心病中的調(diào)控機(jī)制目前仍未完全明確。研究者發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素(IL)-7可調(diào)控T細(xì)胞表面Tim3表達(dá)，參與慢性病毒感染的發(fā)生與發(fā)展〔4〕。本研究在體外培養(yǎng)冠心病患者外周血單核細(xì)胞，觀察IL-7對患者T細(xì)胞表面Tim3的調(diào)控作用，探討IL-7和Tim3在冠心病發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2016年6月至2018年12月宿州市立醫(yī)院收治的冠心病患者164例。均符合2015年中華醫(yī)學(xué)會心血管分會制定的冠心病診治指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除合并肝腎功能不全、糖尿病、腦血管疾病的患者。其中男94例，女70例；年齡56～82歲。根據(jù)患者入院時臨床癥狀、心電圖、心臟彩超、冠脈造影結(jié)果，根據(jù)病情分為：穩(wěn)定型心絞痛組44例、不穩(wěn)定型心絞痛組78例、急性心肌梗死組42例。選取同期在醫(yī)院體檢的性別、年齡相匹配的健康人群40例為正常對照組，其中男24例，女16例；年齡55～80歲。冠心病患者與正常對照組受試者性別、年齡之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液購于上海慧穎生物科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；IL-7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒購于上海西唐生物科技有限公司；兔抗人轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)-5、磷酸化(p)-STAT-5單克隆抗體，鼠抗人細(xì)胞因子信號通路抑制因子(SOCS)3、β-actin單克隆抗體，鼠抗人β-actin單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗人免疫球蛋白(Ig)G、鼠抗人IgG購于美國PeproTech公司。

1.3方法

1.3.1外周血單核細(xì)胞分離及培養(yǎng) 采集各組受試者外周血10 ml，肝素抗凝處理后使用葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll)密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃ 10%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代，細(xì)胞計數(shù)后按1×106/孔的密度接種于24孔板中，設(shè)置3個復(fù)孔，加入終濃度為30 ng/ml的重組IL-7刺激12 h，并設(shè)置無重組IL-7刺激的對照孔正常培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞用于檢測。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測 取各組外周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞檢測管中，磷酸緩沖液洗滌后加入CD3(PERCP)、CD14〔復(fù)合熒光素(APC)-Cy7〕、CD8〔異硫氰酸熒光素(FITC)〕、熒光標(biāo)記(TIM)-4-PE得州紅(Texasred)，避光條件下4℃靜置40 min，磷酸緩沖液洗滌后使用2%多聚甲醛固定后上流式細(xì)胞儀檢測Tim3陽性細(xì)胞占CD4+、CD8+T細(xì)胞的比例。

1.3.3血清IL-7濃度檢測 采集各組受試者清晨空腹外周靜脈血3 ml，2 000 r/min離心10 min，收集上層血清，-20℃保存待測。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清IL-7濃度，試劑盒購于江蘇寶萊生物科技有限公司，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.4Western印跡檢測 取未刺激和重組IL-7刺激12 h后的急性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，離心收集上清，雙辛酸鈉(BCA)定量，行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，滴加兔抗人STAT-5、p-STAT-5單克隆抗體(1∶500)，鼠抗人SOCS3單克隆抗體(1∶300)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜，滴加HRP標(biāo)記的兔抗人IgG，鼠抗人IgG，均為1∶1 000稀釋，室溫下靜置2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，避光顯影，采集圖像，使用Image J軟件分析電泳條帶灰度值。

1.3.5重組IL-7刺激對外周血單核細(xì)胞表面Tim3表達(dá)的影響 選取28例急性心肌梗死組患者和18名正常對照組受試者的外周血單核細(xì)胞，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入重組IL-7刺激12 h后收集外周血單核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞Tim3表達(dá)水平分析 穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組、急性心肌梗死組外周血Tim3陽性細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例明顯高于正常對照組，急性心肌梗死組外周血Tim3陽性細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例明顯高于穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組(P<0.05)。不穩(wěn)定型心絞痛組、急性心肌梗死組外周血Tim3陽性細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的比例明顯高于正常對照組，急性心肌梗死組外周血Tim3陽性細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的比例明顯高于穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組(P<0.05)。見表1。

表1 各組外周血Tim3陽性細(xì)胞占CD4+、CD8+T細(xì)胞的比例

與正常對照組相比:1)P<0.05；與穩(wěn)定型心絞痛組相比:2)P<0.05；與不穩(wěn)定型心絞痛組相比:3)P<0.05

2.2血清IL-7濃度及與CD4+、CD8+T細(xì)胞Tim3表達(dá)的相關(guān)性分析 正常對照組、穩(wěn)定型心絞痛組、不穩(wěn)定型心絞痛組、急性心肌梗死組血清IL-7水平分別為：(36.28±12.61)pg/ml、(39.45±19.30)pg/ml、(40.87±16.75)pg/ml、(67.71±17.48)pg/ml。急性心肌梗死組血清IL-7水平明顯高于正常對照組(P<0.01)；穩(wěn)定型心絞痛組和不穩(wěn)定型心絞痛組血清IL-7水平與正常對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示，血清IL-7濃度與Tim3+CD4+T、CD8+T細(xì)胞比例均無相關(guān)性(r=0.561、0.428，均P>0.05)。

2.3重組IL-7刺激對外周血單核細(xì)胞表面Tim3表達(dá)的影響 正常對照組重組IL-7刺激12 h的CD4+T細(xì)胞表面Tim3表達(dá)水平較未刺激者升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；急性心肌梗死組重組IL-7刺激12 h的CD4+T細(xì)胞表面Tim3表達(dá)水平較未刺激者明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。正常對照組、急性心肌梗死組重組IL-7刺激12 h的CD8+T細(xì)胞表面Tim3表達(dá)水平較未刺激者明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4重組IL-7刺激后外周血單核細(xì)胞中IL-7信號通路相關(guān)分子表達(dá)水平分析 重組IL-7刺激后p-STAT-5蛋白相對表達(dá)量為3.69±0.57，明顯高于未刺激的細(xì)胞中0.52±0.08，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；重組IL-7刺激與未刺激STAT-5蛋白相對表達(dá)量分別為5.53±0.81、5.84±0.97，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；重組IL-7刺激后SOCS3蛋白相對表達(dá)量為3.03±0.45，明顯高于未刺激的細(xì)胞中1.91±0.24，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

表2 兩組IL-7刺激與未刺激的外周血Tim3陽性細(xì)胞占CD4+、CD8+T細(xì)胞的比例

與未刺激相比：1)P<0.05

1未刺激；2 重組IL-7刺激12 h后圖1 IL-7信號通路相關(guān)分子表達(dá)的Western印跡電泳

3 討 論

Tim3為T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白家族成員，其與程序性死亡受體(PD)-1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白(CTLA)4等共同參與腫瘤和病毒感染的發(fā)生、發(fā)展，引發(fā)T細(xì)胞衰竭和免疫耐受〔5〕。抑制Tim3表達(dá)是目前惡性實(shí)體瘤的主要免疫療法之一〔6,7〕。研究者發(fā)現(xiàn)，在抗腫瘤免疫反應(yīng)和適應(yīng)性耐藥性引發(fā)的免疫異常中Tim3表達(dá)上調(diào)僅出現(xiàn)于CD4+、CD8+T細(xì)胞中，抗PD-1藥物與抗Tim3抗體聯(lián)用可有效抑制抗PD-1耐藥性的產(chǎn)生，提升T細(xì)胞的抗癌活性〔8〕。Tim3的免疫抑制活性在部分感染性疾病中能夠發(fā)揮免疫保護(hù)作用〔9〕。丙型病毒性肝炎中Tim3介導(dǎo)的信號通路可通過抑制輔助型T細(xì)胞(Th)17細(xì)胞分泌IL-16，增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性，避免肝細(xì)胞因免疫炎癥反應(yīng)過強(qiáng)而引發(fā)的損傷〔10〕。目前研究認(rèn)為，冠心病屬于炎性疾病的一種，在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中Tim3可通過抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞功能，減少促炎癥因子的分泌，增強(qiáng)斑塊穩(wěn)定性，緩解病情〔11,12〕。本研究顯示，冠心病患者中不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死患者Tim3陽性細(xì)胞占CD4+、CD8+T細(xì)胞比例明顯升高，其中以急性心肌梗死患者升高最明顯，提示Tim3高表達(dá)可能對T細(xì)胞發(fā)揮抑制作用，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫炎癥應(yīng)答，抑制心肌細(xì)胞損傷加重，防止病情進(jìn)展。

IL-7與IL-4、IL-9同屬于共同γ鏈細(xì)胞因子，參與調(diào)控T細(xì)胞生長、分化過程〔13〕。雖然研究者發(fā)現(xiàn)冠狀動脈粥樣硬化患者中IL-7表達(dá)無明顯變化，但I(xiàn)L-7在不穩(wěn)定型心絞痛患者中可與血小板、趨化因子等相互作用，促進(jìn)冠心病惡化〔14，15〕。本研究顯示，IL-7在穩(wěn)定型心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛患者血清中濃度均未出現(xiàn)明顯升高，但在急性心肌梗死患者血清中的濃度明顯高于同年齡段健康人群。為進(jìn)一步探究IL-7在急性心肌梗死患者血清中升高的意義，本研究通過重組IL-7刺激急性心肌梗死患者和同年齡段健康人群中分離的外周血單核細(xì)胞，結(jié)果顯示重組IL-7能夠上調(diào)急性心肌梗死患者CD4+、CD8+T細(xì)胞表面的Tim3表達(dá)。提示重組IL-7誘導(dǎo)的Tim3表達(dá)上調(diào)在可進(jìn)一步促進(jìn)冠心病患者中Tim3的免疫抑制功能，緩解機(jī)體受到的免疫損傷。

研究者發(fā)現(xiàn)，慢性病毒感染過程中，IL-7信號通路促進(jìn)STAT-5磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)細(xì)胞增殖，下調(diào)抑制因子的表達(dá)水平，對抗免疫耐受。本研究對IL-7誘導(dǎo)急性心肌梗死患者外周血單核細(xì)胞中Tim3表達(dá)升高的機(jī)制分析顯示，重組IL-7刺激后，可促進(jìn)STAT-5磷酸化，上調(diào)抑制因子SOCS3表達(dá)，提示IL-7在冠心病患者中的作用可能與慢性病毒感染中的作用完全相反，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。同時，穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛患者血清IL-7濃度無明顯提升，但Tim3表達(dá)水平明顯升高，提示可能存在其他分子機(jī)制誘發(fā)Tim3表達(dá)上調(diào)，仍需進(jìn)一步深入研究。